肺结核感染患者外周血miR-155表达与CD8+T细胞分化的关系

魏连存

[摘要] 目的 探討肺结核感染患者外周血单个核细胞（PBMC）中微小RNA-155（miR-155）表达与CD8+T细胞分化的关系。 方法 选取2017年1月～2019年6月青海省第四人民医院收治88例肺结核感染患者进行研究，其中活动性肺结核42例（活动组），潜伏结核感染者46例（潜伏组），同期体检健康者50名作为对照组。观察三组PBMC中miR-155、T细胞亚群及CD8+T细胞中γ-干扰素（IFN-γ）、白细胞介素-4（IL-4）、IFN-γ/IL-4表达情况，分析不同miR-155表达患者IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4水平及相关性。 结果 活动组、潜伏组PBMC miR-155、CD3+CD8+、IFN-γ、IL-4表达量高于对照组，活动组高于潜伏组（P < 0.05）;活动组IFN-γ/IL-4比值高于对照组（P < 0.05）;活动组、潜伏组PBMC CD3+CD4+细胞比例、CD4+/CD8+比值低于对照组，活动组低于潜伏组（P < 0.05）;miR-155高表达组IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4比值高于miR-155低表达组（P < 0.05）;PBMC miR-155表达与IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4比值呈正相关（r = 0.695，P = 0.000;r = 0.477，P = 0.000;r = 0.446，P = 0.000）。 结论 肺结核患者PBMC miR-155高表达，诱导CD8+T细胞活化，并诱导其向细胞毒性T细胞1表型分化。

[关键词] 肺结核;微小RNA-155;CD8+T细胞;分化;相关性

[中图分类号] R521          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）04（b）-0120-04

The relationship between the expression of miR-155 in peripheral blood and the differentiation of CD8+T cells in patients with pulmonary tuberculosis

WEI Liancun

Department of Laboratory， the Fourth People′s Hospital of Qinghai Province， Qinghai Province， Xi′ning   810000， China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between the expression of microRNA-155 （miR-155） in peripheral blood mononuclear cells （PBMC） and the differentiation of CD8+T cells in patients with pulmonary tuberculosis. Methods A total of 88 patients with pulmonary tuberculosis infection who admitted to the Fourth People′s Hospital of Qinghai Province from January 2017 to June 2019. Among them， 42 cases were active pulmonary tuberculosis （active group）， 46 cases were latent tuberculosis infection （latent group）， and 50 cases were healthy during the same period as control group. The expressions of miR-155， T lymphocyte subsets in PBMC and interferon-γ （IFN-γ）， interleukin-4 （IL-4） and IFN-γ/IL-4 in three groups were observed， the levels of IFN-γ， IL-4 and IFN-γ/IL-4 in CD8+T cells of patients with different miR-155 expression were analyzed. Results The expressions of miR-155， CD3+CD8+， IFN-γ and IL-4 in PBMC of the active group and latent group were higher than those of the control group， and the activity group was higher than the latent group （P < 0.05）， the IFN-γ/IL-4 ratio in the active group was higher than that in the control group （P < 0.05）. The percentage of PBMC CD3+CD4+ cells and CD4+/CD8+ ratio in active group and latent group were lower than those in control group， and the active group were lower than those in latent group （P < 0.05）. The ratios of IFN-γ， IL-4 and IFN-γ/IL-4 in the high expression group of miR-155 was higher than that of the low expression group of miR-155 （P < 0.05）. The expression of PBMC miR-155 was positively correlated with IFN-γ， IL-4 and IFN-γ/IL-4 ratio （r = 0.695， P = 0.000; r = 0.477， P = 0.000; r = 0.446， P = 0.000）. Conclusion PBMC miR-155 is highly expressed in patients with pulmonary tuberculosis， which induces activation of CD8+T cells and differentiation into cytotoxic T ceu 1 phenotype.

[Key words] Tuberculosis; MicroRNA-155; CD8+T cells; Differentiation; Correlation

肺结核是结核分枝杆菌感染肺部所致的一种慢性传染病，与感染菌株数量、性状及患者自身免疫功能相关[1-2]。患者多伴免疫功能异常，而CD8+T细胞及其分泌的细胞因子在细胞免疫中发挥重要作用[3]。而微小RNA（microRNA，miRNA）在机体稳态调节中发挥重要作用，与心血管疾病、传染病及恶性肿瘤等疾病的发生、发展紧密相关[4-5]。miR-155在结核分枝杆菌感染患者血浆中异常表达，可作为肺结核诊断标志物[6]。因此，本研究旨在探讨肺结核感染患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中miR-155表达与CD8+T细胞分化的关系，为其临床治疗及分子机制研究提供临床资料支持。

1 资料与方法

1.1一般资料

选取2017年1月～2019年6月青海省第四人民医院（以下简称“我院”）收治88例肺结核感染患者作为研究对象，其中活动性肺结核42例（活动组），体检检查呈潜伏结核感染者46例（潜伏组），同期体检健康者50名作为对照组。纳入标准：①符合肺结核诊断标准[7];②潜伏感染者为QFT诊断试剂盒检测阳性，而无临床症状者;③年龄>18岁;④研究对象知情，签署知情同意书;⑤经我院医学伦理委员会批准。排除标准：①复治肺结核者;②近6个月有免疫制剂使用史;③伴免疫缺陷性疾病者;④伴内分泌性疾病者;⑤合并恶性肿瘤者;⑥合并乙肝、丙肝者;⑦入组前有抗结核治疗史者。活动组男23例，女19例;年龄21～65岁，平均（45.92±6.58）岁。潜伏组男26例，女20例;年龄22～63岁，平均（44.27±6.82）岁。对照组男27例，女23例;年龄19～64岁，平均（45.18±6.39）岁。三组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。

1.2 PBMC制备

取受试者早晨空腹静脉血10 mL，置于肝素钠抗凝管中，采用Ficoll密度梯度离心法分离、纯化PBMC。

1.3方法

miR-155检测，采用实时荧光定量PCR检测PBMC miR-155表达量，应用miRNeasy Mini RNA试剂盒（QIAGEN，德国，生产批号：20181022）提取PBMC中总RNA，采用Reverse Transcription System试剂盒（Applied Biosystems，美国，生产批号：00963671）逆转录为cDNA，以U6为内参，应用SYBR Green PCR Master Kit試剂盒（Applied Biosystems，美国，生产批号：20180824）进行PCR扩增，采用2-△△CT方法计算miR-155相对表达量，miR-155引物序列，正向引物5′-3′：GGAGGTTAATGCTAATCGTGATAG，反向引物5′-3′：GTGCAGGGTCCGAGGT;U6引物序列，正向引物5′-3′：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT，反向引物5′-3′：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT。

PBMC T细胞亚群检测，采用流式细胞术检测CD4+T细胞、CD8+T细胞及CD8+T细胞内γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4），将PBMC置于流式管中，分别加入CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE，4℃避光染色30 min，流式细胞仪（BD，美国）待检，加入固定液固定，再加破膜液，加IFN-γ-PE-Cy5、IL-4-V450，避光反应45 min，洗涤细胞，磷酸盐缓冲液重悬，上流式细胞术检测。

1.4统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料行正态性检验，符合正态分布，以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用Bonferroni法;采用Pearson相关性分析miR-155与IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4表达的关系。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1三组PBMC miR-155表达

PBMC miR-155表达量活动组（2.95±0.73）高于潜伏组（1.06±0.32）、对照组（0.49±0.14），潜伏组高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.2 三组PBMC T细胞亚群变化

活动组、潜伏组PBMC CD3+CD4+细胞比例、CD4+/CD8+比值低于对照组，活动组低于潜伏组（P < 0.05）;潜伏组、活动组CD3+CD8+细胞比值高于对照组，活动组高于潜伏组（P < 0.05）。见表1。

表1   三组PBMC T细胞亚群变化（%，x±s）

注：与对照组比较，*P < 0.05;与潜伏组比较，#P < 0.05。PBMC：外周血单个核细胞

2.3 三组CD8+T细胞中IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4表达量比较

活动组、潜伏组CD8+T细胞中IFN-γ、IL-4表达量高于对照组，活动组高于潜伏组（P < 0.05）;活动组IFN-γ/IL-4比值高于对照组（P < 0.05），活动组与潜伏组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

表2   三组CD8+T细胞中IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4表达（x±s）

注：与对照组比较，*P < 0.05;与潜伏组比较，#P < 0.05。IFN-γ：γ-干扰素;IL-4：白细胞介素-4

2.4 不同PBMC miR-155表达患者IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4表达

以肺结核患者PBMC miR-155表达中位数为界值，分为低表达组（n = 41）与miR-155高表达组（n = 47）。miR-155高表达组IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4比值明显高于miR-155低表达组（P < 0.05）。见表3。

表3   不同PBMC miR-155表达患者IFN-γ、IL-4、

IFN-γ/IL-4表达（x±s）

注：IFN-γ：γ-干扰素;IL-4：白细胞介素-4

2.5 肺结核患者PBMC miR-155与IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4表达相关性

肺结核患者PBMC miR-155表达与IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4比值均呈正相关（r = 0.695，P = 0.000;r = 0.477，P = 0.000;r = 0.446，P = 0.000）。见图1～3。

IFN-γ：γ-干扰素

图1   肺结核患者PBMC miR-155与IFN-γ表达相关性

3 讨论

miRNA可作为肺结核潜伏感染的高价值生物标志物，在肺结核发病机制中发挥重要作用[8]。Lou等[9]研究显示，miR-223在结核分枝杆菌感染的小鼠肺组织、脾脏组织中高表达，参与肺基质降解。颜保松等[10]研究证实，miR-101、miR-223、miR-424联合检测对肺结核有较高诊断效能。miR-155具有调节肿瘤细胞增殖、分化等作用，还参与免疫炎性反应、微生物感染等过程，结核分枝杆菌能诱导miR-155表达，miR-155过表达能降低Atg3蛋白表达，促进自噬过程[11]。本研究结果发现，与对照组比较，活动组、潜伏组PBMC miR-155表达量升高，活动组高于潜伏组，与杨绍俊等[12]的结果相似，提示肺结核感染患者PBMC miR-155高表达，可能参与其发生发展。T淋巴细胞根据细胞表型不同可分为CD4+T细胞与CD8+T细胞，介导细胞免疫炎性反应[13-14]。结果显示活动组、潜伏组患者PBMC CD3+CD4+细胞比例、CD4+/CD8+比值低于对照组，活动组低于潜伏组，CD3+CD8+细胞比例高于对照组，活动组高于潜伏组，与刘宁等[15]的结果相似，提示肺结核患者存在细胞免疫功能异常现象。在结核分枝杆菌感染时，IFN-γ能活化单核细胞，可强化感染的巨噬细胞的吞噬作用，还有助于体内细菌清除，而IL-4是细胞毒性T细胞（Tc）1亚群的调节因子，还能诱导Tc2分化及辅助性B细胞产生抗体[16-18]。本研究结果显示，活动组、潜伏组患者IFN-γ、IL-4表达显著高于对照组，活动组高于潜伏组，活动组患者IFN-γ/IL-4比值高于对照组，与王赟等[19]的研究结果相似，提示肺结核患者存在Tc1/Tc2失衡现象，并向Tc1偏移。而活动组与潜伏组患者IFN-γ/IL-4比值差异无统计学意义（P > 0.05），可能是由样本量较少所致。miR-155可促进CD8+T细胞增殖及其细胞免疫应答，而miR-155缺乏，CD8+T细胞增殖受到抑制，T细胞分泌IFN-γ能力减弱[20]。此外，miR-155高表达组患者CD8+T细胞中IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4比值高于miR-155低表达组，提示在肺结核患者PBMC miR-155表达与CD8+T细胞的分化相关。可能是miR-155过表达可激活IFN-γ相关信号通路，促进CD8+T细胞向Tc1分化。研究显示，肺结核患者PBMC miR-155表达与IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4比值呈正相关，提示miR-155与IFN-γ、IL-4可能通過某种信号通路协同参与肺结核发生发展。

综上所述，肺结核患者PBMC miR-155高表达，促进CD8+T细胞活化，与IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4比值呈正相关，并诱导CD8+T细胞向Tc1表型转化。

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（收稿日期：2019-09-17  本文编辑：刘永巧）