建立大鼠动脉粥样硬化模型的研究进展

王淑琪 李慧 杨晓强 白云绮 林繄依 高照 孙克寒 聂波

[摘要] 動脉粥样硬化是受累动脉从内膜开始病变的一种常见血管病，是冠心病、脑梗死、外周血管病的主要发病原因，严重危害人类身体健康。建立动脉粥样硬化动物模型对深入了解动脉粥样硬化发病机制、发生发展过程、临床诊断和防治都具有重大意义。通过查阅国内外相关文献，本文归纳和总结大鼠动脉粥样硬化建模方法，比较各种建模方法的优缺点，概述建立动脉粥样硬化动物模型的现状与进展，总结发现单纯高脂饲料喂养很难形成动脉粥样硬化病变，而高脂饲料结合维生素D只能造成早期病变且造模时间较长，但高脂饲料结合维生素D的同时，加以手术机械损伤作用可形成与人类动脉粥样硬化相似的较成熟的病变斑块。

[关键词] 大鼠;动脉粥样硬化;动物模型;研究进展

[中图分类号] R-332          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）04（c）-0045-05

Progress in the establishment of atherosclerosis models in rats

WANG Shuqi1，2   LI Hui1，2   YANG Xiaoqiang3   BAI Yunqi2   LIN Yiyi2   GAO Zhao2   SUN Kehan1   NIE Bo1，2▲

1.School of Traditional Chinese Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing   100029， China; 2.Key Laboratory of Internal Medicine of Traditional Chinese Medicine of Ministry of Education， Beijing Key Laboratory， Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing   100700， China; 3.Department of Stomatology ， Army Equipment Department Clinic， Beijing   100012， China

[Abstract] Atherosclerosis is a common vascular disease that affects the arteries from the intima， and it is the main cause of coronary heart disease， cerebral infarction and peripheral vascular disease. The establishment of an animal model of atherosclerosis is of great significance in understanding the pathogenesis， development， clinical diagnosis and prevention of atherosclerosis. By referring to relevant literatures at home and abroad， this paper summarizes the modeling methods of atherosclerosis in rats， compares the advantages and disadvantages of various modeling methods， and summarizes the current situation and progress of establishing animal models of atherosclerosis. Through the review of related literature at home and abroad， this article induces and summarizes the modeling method of atherosclerosis in rats， and compares the advantages and disadvantages of various modeling methods， an overview of the current situation and progress of establishing animal models of atherosclerosis， and concludes that the simple high-fat feed is difficult to form the atherosclerosis lesions， and high-fat feed combined with vitamin D can cause early pathological changes and the build mode for a long time， but the high fat feedstuff combined with vitamin D at the same time， the mechanical damage to surgery can form and human similar mature lesions of atherosclerosis plaques.

[Key words] Rat; Atherosclerosis; Animal models; Research progress

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）作为一种慢性炎症性疾病，是由多种因素共同作用引起的，发病机制复杂[1]。构建AS动物模型对于探究AS的病因、发病机制、防治和药物研发具有重要意义[2]。目前有关AS的发病机制的假说有：脂质浸润学说、钙超载学说、内膜损伤学说、免疫反应学说等。虽然这些假说都从某一方面解释了AS的发病机制，但这些假说并不能全面的阐述AS的发生、发展过程与机理。在AS的发展过程中，大量脂质在血管中积累，钙质也在血管沉积从而导致血管钙化、血管内皮损伤，此变化加剧了脂质的侵入和损伤，同时又有炎性因子引起的免疫反应，多种因素共同作用导致AS[3]。因此，为了深入探究AS的发病机制，构建一个合适的AS动物模型是非常重要的。

动物模型对于假设验证和临床实验研究是必不可少的，但也存在发病机制不同、病理进程难以控制、操作受限等缺点[4]。目前，AS未有完美的动物模型，常用于研究该疾病的实验动物有：猪、猴、家兔、鹌鹑、大鼠和小鼠等。鼠类因其体型小、生存能力强、繁殖迅速、获取容易等优势一直被作为临床试验中应用范围最广、应用数量最多的实验动物，尤其是ApoE-/-等转基因小鼠被广泛用于复制AS模型，其优点为能自发AS，普食喂养便可形成严重的高脂血症，高脂饮食喂养可加速斑块的形成，且其斑块的分布与人类AS的分布极为相似，但由于体型小、可获得的血液样本少等缺点无法进行类似多指标血液检测等的实验研究。由于大鼠具有应用范围广泛、体型较大、获取容易、饲养方便、死亡率低、能够获取足够的血液及其组织标本等特点，越来越多研究学者更倾向于用大鼠来建立AS模型，故本文对建立大鼠AS模型方法的研究进展做一综述。

1 单纯高脂饲料建立AS模型

AS发病因素多样，其中胆固醇沉积是发生AS的初始过程，脂类是AS形成的物质基础前提条件，其能沉积于血管内膜，从而形成粥样斑块。脂类包括胆固醇及其酯、三酰甘油等物质，脂质代谢紊乱在AS的发生和发展中发挥重要的作用，是导致AS的根本原因。大部分AS模型的建立都是基于大量的脂质再结合其他方法共同构建模型，血浆胆固醇水平与AS的产生呈正相关[5]。因此，建模时的高脂饲料配方多以高比例的胆固醇、猪油等作为脂质来源。高脂饲料配方多由1%～3%胆固醇、8%～10%猪油、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%胆酸钠、5%白糖、81.3%～85.3%普通饲料组成。大量学者研究表明[6-8]，在高脂饲料中添加抑制甲状腺功能的丙基硫氧嘧啶可以引起动物高脂血症的形成和早期粥样硬化病变，且此类药物可以一定程度地降低胆固醇代谢，尽量多地保存动物体内的胆固醇含量;添加胆酸钠可提高脂肪和胆固醇的吸收程度，提高大鼠体内胆固醇含量;加入猪油的目的也是为了提高脂肪含量，并且猪油的黏合度较高可使饲料更好成形，帮助大鼠更好的咀嚼，刺激饮食欲;白糖可以一定程度地转化成脂肪积累，还可以改善丙基硫氧嘧啶和胆酸钠带来的高脂饲料过苦的味道，增强大鼠食欲。

添加丙基硫氧嘧啶的高脂饲料容易导致大鼠食欲减退、食量减少甚至体重下降等现象，给予丙基硫氧嘧啶的方式有直接添加进饲料中、灌胃等，可按不同造模需求进行选择，但剂量的选择则会因不同的喂养方式有一定的差别。纯高脂饲料喂养法构建AS模型的方法优点是操作相对简单，成本也比较低廉，但缺点就是动物成模率较低，且造模周期也较长，无法形成稳定的AS斑块[9]。因此大多数实验研究更倾向于在高脂饲料喂养的基础上联合应用其他损伤操作，达到构建模型更好更快的目的。

2 高脂饲料联合维生素D建立AS模型

由于大鼠无胆囊的生理结构特点，造成大鼠对胆固醇等脂质吸收较少，单纯的高脂饲料喂养只能造成大鼠体内脂质沉积，难以造成与人类相似的AS斑块产生与病变，因此高脂饲料结合一些可以导致或加速AS形成的药物共同作用于大鼠，可有效的提高模型复制效率。大量学者研究发现，人类AS患者的血管壁中含有大量的钙物质，其含量与冠心病的病变程度呈正相关[10]。维生素D3作为钙离子诱导剂，可促进血钙吸收，损伤动脉血管壁内皮，破坏其完整性，有利于脂质侵入并加重血管壁损伤，再结合钙盐沉积，使平滑肌细胞变性，从而加速动脉病变形成斑块[11]。Yang等[12]采用含1%胆固醇高脂饲料联合维生素D3（700 000 U/kg）的制备方法于饲养6周后成功建立稳定、可重复的AS模型。Song等[13]以高脂饲料为诱导联合腹腔注射维生素D3注射液，6周后成功复制AS大鼠模型。AS模型大鼠的主动脉内皮细胞增殖，泡沫细胞堆积，主动脉内膜介质明显厚于正常组的主动脉内膜，与正常组大鼠的AS病变比较，AS模型组病变明显增加。

通常高脂饲料结合维生素D3来建立AS模型，但也有不少研究采用维生素D2来代替维生素D3复制AS模型。董兆旻等[14]利用高脂饮食和1次维生素D2注射成功建立了SD大鼠模型。维生素D3与维生素D2没有太大的区别，两者之间的区别在于化学结构不同，维生素D2为麦角骨化醇，维生素D3为胆骨化醇，而对于体内的代谢与作用机制完全相同，通过肝脏和肾脏的羟化作用，最终代谢产物是一样的，文献中均有使用[15]。

使用维生素D配合制备AS模型的方法有多种，常用腹腔注射法、灌胃或直接大剂量添加到饲料中，可根据不同的实验需求和目的自行選择。关于维生素D给药剂量和给药时间经查阅文献后发现，各研究者的结论不尽相同，缺乏统一的认识与规范。Hu等[16]在制备AS模型开始时，将每只大鼠腹腔注射维生素D3 700 000 U/kg，分3次给药，1次/d，以此复制大鼠AS模型。周红等[17]在制备大鼠AS模型前每只大鼠腹腔注射600 000 U/kg，造模后第3、6、9周各腹腔注射100 000 U/kg的维生素D3是比较有效的构建AS大鼠模型的方法，具有成模率高、死亡率低等优点，且发现用高脂饲料联合维生素D3制备AS大鼠模型时，维生素D3剂量过小，很难造成典型的AS血管病变;而剂量过大更易诱导出AS病变，但会导致大鼠体重下降明显，饮食量降低，造成高达40%的死亡率。

高脂饲料喂养结合维生素D2/D3复制模型的实验方法优点是实验操作比较简单，大鼠的整个AS发生发展过程比较稳定，这种方法比较好地弥补了AS病变过程中里只有胆固醇沉积而缺少钙沉积的缺点，是一种比较有效且常见的AS模型复制方法[18]。此方法发生的主要病理变化为血管壁钙质沉积，内膜损伤，中膜纤维细胞明显增生，并形成纤化灶，内膜下层有泡沫细胞浸润，主要体现出AS早期的病理状态，无法快速形成成熟的粥样斑，但动脉钙质沉积且钙化对于评估和预测心肌梗死、脑卒中或死亡以及积极预防和治疗心脑血管疾病亦具有重要的临床意义[19]。

采用此方法制备AS模型时对于维生素D的给药剂量及给药周期要求比较严格，给药剂量太高或者过低都不利于模型的成功复制。剂量过高会导致大鼠厌食严重、体型消瘦、体重减轻甚至死亡，过低又不易形成AS典型病理状态，因此，在造模过程中应密切观察动物的精神状态、饮食情况和体重变化，结合自身的实验需求进行复制模型，但此造模方式耗时较长，要保持足够的耐心。

3 高脂饲料联合免疫炎症建立AS模型

1999年，Ross[20]提出AS是一种炎症性疾病，炎性细胞通过吞噬作用清除脂质物质，同时形成泡沫细胞，并形成脂质沉积核心，引起AS斑块的形成[21]。此外，可能与其他炎性因子相互作用促进AS的发生。随着研究的不断深入，AS中新的细胞因子不断检出，炎性因子已成为AS病变过程中的重要因素[22]。周丽程等[23]利用大鼠腹腔注射维生素D3和卵清白蛋白致敏，造成大鼠免疫炎症，高脂饲料喂养14周后大鼠主动脉出现AS斑块。

从免疫学角度建立AS模型是可行的，遵从AS的形成是多种机制共同作用的结果，但此方法尚在起步阶段，许多方面不成熟，且此方法难免会对动物产生免疫损伤等不良反应。

4 机械损伤法建立AS模型

虽然以上3种方法在操作性和可行性上都能成功的复制AS模型，但不足的是实验周期过长，为了弥补这一缺点，研究学者们在高脂饲料喂养下联合手术的直接损伤作用于大鼠可加速AS的病变进程。主要的手术应用有以下几种：

4.1 球囊损伤术

球囊损伤术是制备血管损伤后再狭窄模型的常见方法，此方法的主要操作是将一定直径大小的球囊放入动脉血管后充盈球囊，通过反复拖拉充盈后的球囊造成动脉血管内皮细胞损伤，造成内皮细胞的即刻脱落，弹力板及中膜严重损伤，引起局部血管狭窄。Yin等[24]以高脂饲料喂养为基础联合腹腔注射维生素D3和球囊损伤手术于饲养大鼠8周后成功复制AS模型，手术组大鼠较假手术组大鼠有明显的AS斑块形成。蔡宏文等[25]将高脂饲料喂养、维生素D3腹腔注射和球囊损伤术联合应用建立大鼠AS模型，给予大鼠1次性腹腔注射维生素D3 400 000 U/Kg，高脂喂养7 d后进行球囊手术，6周后造模成功。

进行球囊损伤手术时需要注意选择内径大小适宜的球囊，牵拉过程中速度、力度的把握以及对球囊扩张压力的控制。球囊扩张太过、来回牵拉太快或操作人员用力过大都会容易造成动脉的破裂，过度损伤;反之扩张不够、牵拉过于缓慢又不能造成有效的内膜损伤，所以建立成功的AS模型[26]，球囊損伤术对操作人员技术要求比较高。在球囊损伤手术之后的3～5 d需密切观察动物状态，还需腹腔注射青霉素钠防止术后感染，造成不必要的死亡与损伤。

4.2 电击损伤术

此方法原理为通过一定的电击刺激可引起血管内膜损伤，激活血小板，血小板聚集后会释放出一些活性物质，这些物质则会促进内皮细胞损伤，使其损伤加重，随着时间的延长，可形成明显的AS斑块。尚晓玲等[27]利用高脂饲料及颈动脉电击损伤联合作用制备AS模型，通过对影响因素的多次实验筛查，最终大鼠高脂饮食联合腹腔注射维生素D2加颈动脉电击损伤（1 mA、5 min）复合因素所致的AS模型建立成功。

此手术方法对于电流强度与电击时间要求比较严格，电流强度过大时容易造成动脉血管壁出现比较明显的焦灼痕且容易导致动脉穿孔，电击造成的损伤严重破坏动脉血管壁结构，导致大鼠死亡率增高，这也是大多数研究者不常采用此方法的原因之一;电流强度过小时即使增加电击时间也不易引起血管壁损伤，形成AS病变。

4.3 动脉钳夹术

手术动脉钳夹法的原理是机械压迫阻断动脉正常供血，导致局部血管缺血缺氧，颈动脉内膜损伤，引发炎性反应，进而促进AS的发生。王庆林等[28]使用血管钳夹住大鼠一侧颈动脉20 min，手术后以高脂饮食喂养，6周时大鼠动脉内膜便有明显增厚，大量泡沫细胞聚集的现象，10周时形成典型纤维帽，成功建立大鼠AS模型。

此方法建立AS大鼠模型的优点在于能够人为控制AS的形成或病变部位，比较有利于对AS的并发症脑卒中的研究[29]，但此种造模方法的缺点是对实验人员的操作技术要求较高，且手术中的不稳定因素较多，在大鼠造模中的个体差异较大，不易形成稳定的AS病变和统一的AS模型。

5 结语

AS是常见的心血管疾病，建立不同阶段的人类AS病理变化和发病过程的理想动物模型对于提高心血管疾病的防治尤为重要。

从AS的发病机制出发，脂类沉积、血管钙化、炎症、免疫机制或机械损伤引起内膜受损是建立大鼠AS模型的前提，各种构建AS动物模型的方法在模型形成时间、动脉硬化程度及病变发展上都有所不同，应根据研究目的来选择。

从AS的病理变化状态出发，当机体内血脂异常升高时，升高的脂质会聚集于动脉壁，形成肉眼可见的脂质条纹，进而演化为纤维斑块，最后生成黄色粥样斑块，这是AS典型的病理变化[30]。就以上所述的几种建模方法而言，纯高脂饲料喂养很难导致AS病变，且造模周期较长;高脂饲料结合维生素D诱导只是导致大鼠形成AS早期的病理状态，并没有形成成熟的与人类病变相似的AS斑块;大鼠高脂饲料喂养及维生素D损伤的同时，结合手术机械损伤作用可形成与人类AS相似的较成熟的AS斑块。随着研究学者们对AS的不断深入了解与探究，相信一定会有一种比较完美的规范的与人类病理状态相似的大鼠AS模型。

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（收稿日期：2019-09-09  本文编辑：顾家毓）