基于网络药理学和分子对接技术探究柴胡-葛根治疗肺炎支原体肺炎引起发热的作用机制*

李艳娇，李焕敏，孙 丹，韩耀巍，李新民△

（1.天津中医药大学第一附属医院/国家中医针灸临床医学研究中心，天津 300380；2.天津中医药大学，天津 300160）

肺炎支原体肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）是一种儿童常见的社区获得性肺炎。患儿临床表现轻重不一，以发热和咳嗽为主要临床症状。MPP患儿中约44.4%可出现发热，重症MPP均伴有发热症状，其中88.5%出现高热（体温≥39℃）[1]。及时退热是改善患儿舒适度的重要治疗措施，是评价MPP疾病疗效的重要指标。MPP相关指南推荐以大环内酯类抗生素为主，对乙酰氨基酚、布洛芬等退热药为辅助的治疗措施[2]，但部分患儿存在对药物不耐受以及耐药等情况，特别是布洛芬的胃肠道副作用，以及阿奇霉素的耐药问题[3]，从而导致预后不良。

中医的药对是以两味中药为基础的配伍单位，历经多位医家的临床实践传承，体现了中医辨证思想以及组方用药规律。中药药对调节发热的优势不容小觑，具有多靶点多通路以及安全稳固的特点。网络药理学是基于药学、计算机学、分子生物学等多学科理论基础，运用生信分析手段探讨药物与疾病靶点之间的相互作用的重要方法。分子对接技术是运用计算机不同的算法对分子间的亲和力进行几何匹配和能量匹配的过程。分子对接和网络药理学作为计算机辅助医药领域的2项重要技术，为中医药在实现研究方法严谨规范、研究深度微观具体，研究范围医药精准对接方面提供了有力的支持。

本研究以天津名中医李新民教授治疗MPP发热患儿的常用药对柴胡-葛根为物质基础，运用网络药理学和分子对接的技术手段，从中医的整体辨证角度分析药物成分靶点的微观作用机理，探讨柴胡-葛根治疗MPP发热症状的作用机理。

1 材料与方法

1.1 柴胡-葛根相关靶点筛选 TCMTS（Https：//tcmspw.com/tcmsp.php）是一个独特的中草药相关药理学平台，载有药物、靶标和疾病之间的关系。利用TCMTS平台查找2味中药的活性成分，活性成分初筛标准设置为口服利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%，且类药性（Drug-likeness，DL）≥0.18，后查找文献进行补充。编辑整理中药活性成分对应的靶点信息。

利用Uniprot（Https：//www.uniprot.org/）筛选“Homo sapiens”“Reviewed”的所有蛋白质靶点。与上述获得的中药活性成分靶点匹配，再进一步整理，即为柴胡-葛根活性成分相关靶点信息，导入Cytoscape3.7.2中构建网络互作图。

1.2 引起疾病MPP和发热症状的相关靶点筛选 以“Mycoplasma pneumoniae pneumonia”和“fever”为关键词，挖掘 GeneCards数据库（Https：//www.genecards.org）、OMIM 数据库（Http：//www.omim.org）中引起MPP发热的作用机理。GeneCards数据库的选取标准为score大于中位数。合并2个数据库疾病靶点，删除重复项，即为引起疾病MPP和发热症状的相关靶点。

1.3 柴胡-葛根成分与MPP发热症状靶点PPI网络为探究柴胡-葛根药物相关靶点与MPP发热间的相互作用，利用Bioinformatics&Evolutionary Genomics（Http：//bioinformatics.psb.ugent.be/）绘制韦恩图。获取的交集基因导入 STING（Https：//string-db.org）数据库构建PPI网络图，网络构建标准设置为“Homo sapiens”“Highest confidence ＞ 0.9”，其余为默认值。结果保存并导入Cytoscape3.7.2中，利用MCODE插件，设置参数为 Degree Cutoff：5，K-core：5，其余设置不变，筛选潜在蛋白质功能模块和相对应的关键靶点信息。

1.4 柴胡-葛根成分与MPP发热症状功能、通路富集 将上述过程得到的柴胡-葛根成分与MPP发热症状关键靶点信息导入Metascape（Https：//metascape.org/），选择“Homo sapiens”，“P＜0.01”，分析其主要的生物学过程与代谢通路并进行富集分析。利用ImageGP（Http：//www.ehbio.com/ImageGP/）进行数据可视化分析。

1.5 柴胡-葛根成分—MPP发热症状靶点—通络网络图的构建 把柴胡-葛根成分、交集关键靶点和KEGG通路导入Cytoscape3.7.2中构建柴胡-葛根成分—MPP发热症状靶点—通路网络图，并分析连接度（Degree）、介度（Betweenness）以及紧密度（Closenesss）等网络拓扑参数。导出网络图及表格，分析主要活性成分及主要关键靶点通路。

1.6 分子对接验证 分析得到柴胡-葛根成分—MPP发热症状靶点网络图中度值排名前3的靶点，登录RCSB PDB（Https：//www.rcsb.org/），设置“Homo sapiens”“Refinement resilution（A）1.5-3”结合文献研究及3D构象选取这3个靶点的PDB ID。利用Pub－Chem（Https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查找柴胡-葛根活性成分的2D结构，再导入Chemoffice中构建活性成分的3D结构。然后利用autodocktools1.5.6进行分子对接，所有对接结果用ImageGP平台进行可视化分析。最后利用Pymolwin绘制主要中药活性成分与关键靶点分子对接示意图。

2 结果

2.1 获取柴胡-葛根活性成分 初步提取柴胡化学成分349种，葛根成分18种，经过OB、DL筛选后获得柴胡13种，葛根4种活性成分，包括槲皮素、山奈酚等，详见表1。柴胡作用靶点336个，葛根136个，去掉重复靶点，一共获得205个靶点，详见图1。

图1 柴胡-葛根成分靶点网络图

表1 柴胡-葛根主要活性成分及靶点信息

2.2 引起疾病MPP和发热症状的相关靶点筛选 从Genecards数据库获得MPP靶点314个，发热靶点7 390个，根据Score大于中位数的目标靶点筛选潜在靶点，再结合OMIM进行补充，删除重复项，最终获得MPP发热靶点1 057个。

2.3 柴胡-葛根成分与MPP发热症状靶点PPI网络将筛选的柴胡-葛根活性成分靶点与MPP发热症状靶点取交集，并利用Bioinformatics&Evolutionary Genomics绘制韦恩图，见图2，得到疾病与药物的共同靶点39个。再将靶点导入STRING，构建柴胡-葛根靶点PPI网络，见图3。

图2 柴胡-葛根与MPP发热症状韦恩图

图3 柴胡-葛根与MPP发热症状靶点PPI网络

PPI复杂网络中存在部分密度较高的区域称为module，module被认为是一种功能模块，高度富集同一功能集团的蛋白质。在获得柴胡-葛根与MPP发热症状靶点PPI网络后，导入Cytoscape3.7.2的MCODE插件中，设置参数，获得内在13个核心靶点组成的module，见图4。进一步利用 Network Analyzer计算分析了上述13个核心靶点的度值，见表2。据表所示核心靶点的度值相对较高，尤其是IL-6、TNF、IL-1β在网络体系中有较高的作用。

图4 柴胡-葛根与MPP发热症状靶点PPI网络中的module

表2 柴胡-葛根与MPP发热症状核心靶点信息

2.4 柴胡-葛根成分与MPP发热症状功能、通路富集 把柴胡-葛根成分与MPP发热症状的13个核心靶点导入Metascape，整理结果，利用ImageGP平台使数据可视化。根据图5（A）所示，柴胡-葛根治疗MPP发热的主要生物过程包括细胞黏附的正向调节 （Positive regulation of cell adhesion）、JAK-STAT通路（JAK-STAT cascade）、对脂多糖的调节（Re－sponse to lipopolysaccharide）、白细胞的游动（Leukocyte migration）、上皮细胞的凋亡（Regulation of epithelial cell apoptotic process）、血管再生（Angiogenesis）、平滑肌细胞增殖（Regulation of smooth muscle cell proliferation）等。参与的通路包括细胞因子-细胞因子受体相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction）、IL-17 调节通路（IL-17 signaling pathway）等，详见图 5（C），表 3。

图5 柴胡-葛根主要成分潜在的富集靶点

表3 柴胡-葛根调节MP发热症状的通路信息

相关靶点调节分子生物功能主要富集在细胞因子活性（Cytokine activity）、细胞因子受体结合（Cytokine receptor binding）、受体配体活性（Receptor ligand activity）、生长因子受体结合（Growth factor receptor binding）等，见图 5（B）。

2.5 柴胡-葛根成分—MPP发热症状靶点—通络网络图的构建 运用CytoScape3.7.2构建柴胡-葛根与MPP发热症状靶点-通路网络，见图6。利用Cytoscape的NetworkAnalyzer功能分析柴胡-葛根中药成分的度值，发现主要为槲皮素，其次为山奈酚，两者可能是干预与MPP发热症状的最主要成分，详见表4。

表4 柴胡-葛根网络节点特征参数

图6 柴胡-葛根成分—MPP发热症状靶点—通络网络图

2.6 分子对接验证结果 分子对接结果显示Docking Score绝对值大于等于7的有7个，大于等于5小于7的有30个，小于5且大于等于4.25的有8个，小于4.25的有6个，详见图7。Docking Score绝对值大于4.25表示活性成分与靶点间存在结合能力，大于5.0时表示结合活性较强，大于7时表示结合活性极强，结果表示Docking Score绝对值大于4.25者占总数88.24%，大于5的占72.55%，大部分靶点与成分的结合活性较好。中药活性成分槲皮素、山奈酚、刺芒柄花素和β-谷甾醇与3个靶点的结合活性均较强。

图7 分子对接结果热图

利用Pymolwin绘制槲皮素、山奈酚与IL-6、TNF、IL-1β的分子对接示意图，如图8。中药主要活性成分与关键靶点的结合氢键距离均小于3.5A，符合要求。且大部分结合氢键距离小于3A，属于较强氢键。

图8 槲皮素、山奈酚与关键靶点对接结果示意图

3 讨论

发热是呼吸道感染常见的症状，持续发热，热退复现是公认的儿童难治性肺炎支原体肺炎的临床表现[4]。蒋星华等[5]对920例MPP感染患儿的临床资料进行回顾性分析，结果显示肺炎支原体感染出现发热的患儿达70.98%，高热的患儿占发热病人总数70.90%。中药复方治疗MPP患儿的发热症状具有优越的疗效。课题组对266例风热闭肺型MPP患儿进行回顾性研究，发现中药组的退热时间与西药组的退热时间有明显的统计学差异，中药组优于西药组[6]。李天力等[7]在对中成药小儿消积止咳口服液联合阿奇霉素治疗儿童MPP的Meta分析中发现，联合口服中成药能提高治疗儿童MPP的临床总体疗效，包括退热时间、咳嗽消失时间以及啰音消失时间，且具有较好的安全性。动物实验显示，中医药可能通过调节NF-κB通路、IL-17通路干预MPP小鼠模型，改善MPP小鼠的发热、咳嗽症状[8-9]。

对MPP的临床研究中发现中，闫慧敏教授[10]收集81例难治性MPP患儿临床资料，认为急性高热期及低热起伏恢复期病位在肺脾，血瘀是贯穿难治性MPP的重要病理因素。宫文浩[11]对493例儿童MPP进行临床数据挖掘，发现小儿MPP临床辨证可采用温病学郁热辨证方法，分为卫分无形郁热证、积滞热结证、痰热郁结证等6种郁热类型。基于中医临床的辨证总结，课题组认为MPP的主要病机为肺气闭郁、瘀血阻络，治疗MPP患儿急性发热期，多采用宣肺清热、化瘀通络，在主方麻杏石甘汤的基础上加减用药，其中柴胡-葛根为常用退热药对。柴胡为伞形科植物，根据形态分为北柴胡、南柴胡。《本经》言其可医“寒热邪气”；《别录》言其可“除伤寒心下烦热”；《药性论》言其可散“热气”；《医学启源》言其可“除虚劳烦热，解散肌热，去早晨潮热”。葛根为豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根茎，《本经》言其主“身太热”；《别录》言其可“出汗”，疗“壮热”；《药性论》言其“治时疾解热”；《本草拾遗》言其可医“身热赤”。综上可见，柴胡、葛根自古以来就被各位医家作为治疗发热的常用药。现代动物实验表明大剂量的柴胡煎剂（5g生药/kg）或醇浸膏（2.5g生药/kg）对人工发热的家兔有解热作用。对用伤寒混合疫苗引起发热之家兔，口服煎剂或浸剂（2g/kg），也有轻度的降温作用[12]。日本产葛根浸剂对人工发热家兔有明显解热作用，维持4～5h 之久[13]。

本研究通过网络药理学方法初步筛选出柴胡-葛根治疗MPP发热症状的活性成分山奈酚、β-谷甾醇、槲皮素、刺芒柄花素等。肺部炎症是引起MPP发热的最主要原因。槲皮素是一种不含碳水化合物的黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、镇痛的作用。对槲皮素的基础研究表明，槲皮素对肺的氧化应激损伤有一定的保护作用[14]，对大鼠气道炎症和粘液生成有一定的抑制作用[15]。槲皮素还可以通过下调肺成纤维细胞的miR-221、抑制NF-κB和JNK途径改善病原体来源的脂多糖引起的肺损伤[16]。槲皮素具体的抗肺部炎症的机制，一方面可能是通是过阻断NF-κB和AP-1信号通路抑制TNF-α诱导的血管内皮细胞凋亡和炎症反应[17]，另一方面则可能是通过调节机体相关细胞因子的表达，改变病原菌的局部环境，进而抑制病原体的生长[18]。另外柴胡-葛根其他活性成分，如山奈酚亦可以通过MAPK和NF-κB途径抑制病原菌引起的炎症反应[19]。分子对接结果显示槲皮素、山奈酚与主要靶点（IL-6、TNF、IL-1β）的结合活性较强，说明柴胡-葛根可能主要通过槲皮素、山奈酚调节MPP引起的发热症状。

本研究表明，柴胡-葛根调节MPP发热症状的靶点在IL-6、TNF。IL-6是一种在炎症和B细胞成熟过程中起重要作用的细胞因子，其编码的蛋白质是一种内源性致热源，在免疫性疾病及感染性疾病中可以引起发热。IL-6在急慢性炎症部位产生，通过血液分布到全身，通过与IL-6受体α的作用，诱导炎症相关因子转录。临床数据显现，IL-6明显升高可能是MPP患儿的主要临床特征[20-21]。通过对MPP患者中IL-6的单核苷酸多态性进行研究，发现IL-6 rs1800795与MPP的风险显著相关[22]。进一步研究表明MPP的发病机制可能与触发miR-1323/IL-6轴，爆发炎症反应有关[23]。TNF是也一种内源性致热源，是难治性肺炎支原体肺炎的预警指标[24]，其亚组分TNF-α是参与NF-κB信号通路参与MPP的炎症过程的关键分子[25]。柴胡-葛根调节MPP发热症状的通路主要涉及IL-17调节通络（hsa04657）以及NF-κB信号通路（hsa04657）、Th17细胞分化（hsa04659）等。Th17细胞主要分泌的细胞因子为IL-17，Treg/Th17两种细胞的失衡，是包括MPP在内的多种炎性及免疫性疾病的重要表现[26-27]。IL-17与MPP患儿的病情严重程度以及哮喘发作相关[28-29]。临床资料显示，儿童MPP患者外周血单核细胞中TLRs的表达存在异常改变且与NF-κB信号通路激活有关[30]。NF-κB通路的效应分子涉及IL-6、IL-1β，是本研究中分析得到的关键靶标。故推测柴胡-葛根调节MPP发热症状的关键信号通路为IL-17信号通路和NF-κB信号通路。

本研究表明，柴胡-葛根的单一活性成分可以从不同的靶点调节MPP的发热症状，而同一靶点又可以影响不同的生物细胞过程，体现了中医中药发挥作用的多层次，多靶点，多联合性。单一靶点“牵一发而动全身”的调节方式，为中医药整体观的辨证思想研究提供了科学依据，为后续进一步挖掘柴胡-葛根等中药药材开发扩宽了道路。但网络药理学是基于数据挖掘的一种研究手段，其本身就具有一定的局限性，再加上中药材炮制方法、采集时间、采集品种等的差异性，给分析结果带来了一定的不确定性。我们后期可以基于分析得到的关键靶点及通路，做进一步的实验验证，挖掘中药治疗MPP的深层机制。