雄性Kunming-DY大鼠血尿酸水平的主要影响因素*

范 楠，段为钢，云 宇△

（1.昆明医科大学基础医学院药理学系，云南 昆明 650500；2.云南中医药大学云南省中医药学分子生物学重点实验室，云南 昆明 650500）

痛风及其他高尿酸血症相关性疾病是现代社会的常见病和多发病，男性相较于女性易发和多发。其发病机制仍未完全清楚，但认为主要与体内嘌呤代谢紊乱、尿酸排泄异常和嘌呤摄入过多有关[1-2]。研究发现，高尿酸血症是痛风的基础病症，与高血压、II型糖尿病、高血脂等疾病有着紧密联系[3]，高尿酸血症俨然已成为严重危害人类健康的“第四高”[4-5]。尿酸难溶于水，在尿酸酶缺失机体内易产生结晶沉淀，因此人类易发生高尿酸血症甚至痛风。中医药在降低血尿酸，防治痛风方面显示了诸多优势[6-8]。为了更好地认识高尿酸血症的发生发展过程，评价中医药的降尿酸效果，课题组前期以Sprague-Dawley（SD）大鼠为背景，先用CRISPR/Cas9技术敲除尿酸酶基因获得杂合子（Uox+/-）大鼠，然后通过反复交配和筛选获得纯合子（Uox-/-）大鼠（尿酸酶缺失大鼠），命名为Kunming-DY大鼠[9-10]，其血尿酸水平与人接近。该大鼠已成功用于评价中成药排毒养颜胶囊的降血尿酸作用[11]。本研究以野生型SD大鼠和Uox+/-大鼠为参照，探讨尿酸酶缺失对Kunming-DY大鼠饮食和尿酸排泄的影响，饮食与尿酸排泄之间的内在规律，对大鼠一般健康状态的影响，为认识尿酸酶缺失对人类饮食和尿酸排泄的影响提供参考，并为此大鼠作为评价药物降尿酸作用的模型动物提供详实的生命健康数据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性Kunming-DY大鼠（Uox-/-）按照前期报道方法自制[9]，53只，雄性尿酸酶缺失杂合子大鼠（Uox+/-）自制5只，雄性野生型SD大鼠（WT）自制6只，日龄均为45 d。饲养于SPF环境，温度（22±2）℃，相对湿度 40%～60%，自由饮食。

1.2 试剂与仪器 磷钨酸法尿酸检测试剂盒（南京建成生物工程研究所生产，货号：C012-1-1）；TRIS碱（Scientific Research Special生产，货号：0497-500）；全波长酶标仪（北京凯奥科技发展有限公司生产，型号：K6600-A）；电子天平（中国·凯丰集团有限公司生产，型号：KF-H2）。

1.3 动物处理 选取日龄45 d的雄性大鼠，称重，断尾取血约0.2 mL，3 000×g离心5 min分离血清用于血尿酸（SUA）、血肌酐（Cr）和血尿素氮（BUN）测定。然后将其放入代谢笼中，监测其24 h进食量、饮水量、尿液排泄量和粪便排泄量。进食指数为大鼠每100 g体质量的24 h进食量，同理计算其他指数如饮水指数、尿酸排泄指数等，以考虑体质量的干扰。

1.4 尿酸含量、血肌酐和血尿素氮测定 血尿酸（SUA）、血尿素氮（BUN）和血肌酐（Cr）分别按照试剂盒说明书操作，然后用酶标仪测定其吸光度。

将收集到的24 h尿液混匀后用50 mmol/L TRIS碱溶液稀释20倍，按试剂盒说明书检测其尿酸含量。粪便则加入3份量（重量）100 mmol/L TRIS碱溶液于摇床上（100 r/min）进行混匀提取，10 000×g离心后取上清测定其中的尿酸含量。

2 结果

2.1 Kunming-DY大鼠的饮食、体质量变化 Kunming-DY大鼠（Uox-/-）第45天的进食量与野生型（WT）和杂合子（Uox+/-）大鼠无明显差异（图 1A），但 Kunming-DY大鼠的饮水量有增加趋势，与杂合子相比有统计学差异（图1B）。由于Kunming-DY大鼠的体质量增长较慢（图1E），因此进食指数（图1C）和饮水指数（图 1D）明显增加。

图1 Kunming-DY大鼠的饮食、体质量变化

2.2 Kunming-DY大鼠的血清指标变化 Kunming-DY大鼠的血尿酸值明显升高，接近男性成人水平，与前期报道一致[9]，同时杂合子大鼠的血尿酸水平也有增加趋势（图2A）。与野生型大鼠相比，Kunming-DY大鼠的BUN（图2B）和Cr（图2C）均显著升高；提示Kunming-DY大鼠有一定程度的肾损伤，与前期报道一致[9]。

2.3 Kunming-DY大鼠尿液变化 Kunming-DY大鼠尿液中的尿酸含量增高（图3A），24 h尿液排泄量明显增加（图3C、3D），因此24 h尿液尿酸排泄量也明显增加（图 3B、3E）。

图3 Kunming-DY大鼠尿液中尿酸的变化

2.4 粪便 Kunming-DY大鼠粪便中的尿酸含量有增加趋势，与杂合子相比显著增加（图4A）。24 h粪便排泄量也有增加趋势，与杂合子相比也显著增加（图4C、4D）。因此，与杂合子相比，Kunming-DY大鼠24 h粪便尿酸排泄量也明显增加；奇怪的是，与野生型相比，杂合子大鼠的24 h粪便排泄量是减少的（图3B、3E）。

图4 Kunming-DY大鼠粪便中尿酸的变化

2.5 Kunming-DY大鼠尿酸总排泄量变化 根据已有的认识，尿酸主要经肾排泄，占比2/3以上，肠道是尿酸排泄的次要途径，占比不到1/3，两者之和近似于尿酸的总排泄量。从本研究看，Kunming-DY大鼠24 h的总尿酸排泄量较Uox+/-大鼠和野生型大鼠明显增加（图5A、5B）。从总尿酸排泄中的尿液尿酸比来看，WT大鼠和Uox+/-大鼠的尿液尿酸排泄占3/4左右，Kunming-DY大鼠尿液尿酸排泄的占比增加到9/10左右（图5C）。

图5 Kunming-DY大鼠尿酸排泄总量变化

2.6 饮水和尿量关系分析 在24 h出入量分析中，Kunming-DY大鼠的饮水量和尿液量变化较大。动物的饮水一部分从呼吸中散发，一部分从皮肤蒸发，一部分则从粪便带出，当然最主要的还是生成尿液。从尿量占饮水量的比值看，Kunming-DY大鼠增加的饮水主要是生成了尿液（图6A），该占比与野生型大鼠相比具有统计学意义。从饮水尿液量差值看（图6B），各组也有一定差异趋势，但总体上均未见统计学差异。

图6 Kunming-DY大鼠饮水和尿量关系分析

2.7 Kunming-DY大鼠各指标的相关性分析 将各指标进行两两相关性分析（表1）发现，SUA与进食指数负相关，与体质量也存在负相关；这意味着对Kunming-DY大鼠而言，尿酸的来源主要是内源性的，而不是由食物导致，在同龄条件下，体质量轻的大鼠血尿酸反而高。

表1 Kunming-DY大鼠各指标相关性分析

对于体质量因素来说，该因素除了与SUA负相关外，还与排尿指数、进食指数和饮水指数负相关，说明Kunming-DY大鼠的体质量越大，相对而言，饮食反而减少，导致排尿量也减少。然而，体质量与Cr的相关性较高，提示体质量的增加可能对肾功能不利。

需要说明的是，Cr与排尿量指数、尿液尿酸指数、粪便尿酸指数、总尿酸排泄指数呈负相关，和体质量与BUN呈正相关；BUN与粪便尿酸指数呈负相关，与血肌酐呈正相关。这说明排尿增多、尿酸排泄增多有利于肾功能，与传统认识一致。

3 讨论

Kunming-DY大鼠是课题组前期研制的一种尿酸酶缺失大鼠[9]。与文献报道的尿酸酶缺失小鼠不同[12-13]，该大鼠可以长期存活，血尿酸水平没有异常增高。Kunming-DY大鼠的血尿酸水平与同性别人群的血尿酸水平相似，用该大鼠尿酸变化规律推测人类尿酸变化规律具有较好的参考价值。

本研究中，尿酸酶缺失后，相同日龄的大鼠进食量变化不大，Kunming-DY大鼠与野生型和杂合子大鼠相比，体质量明显偏轻，继而导致进食指数明显增加。Kunming-DY大鼠的SUA、Cr、BUN明显升高，推测该大鼠由于尿酸酶缺失可能存在轻度的肾功能损伤。SUA升高，大鼠尿酸排泄代偿机制增加[14]，即尿液尿酸和粪便尿酸同时在浓度（含量）和24 h排泄总量上均明显增多，这支持肠道或肾脏途径能代偿性排泄尿酸的理论[5，15]。结果显示，尿酸排泄增多最主要还是通过肾脏排泄途径来实现，通过尿液和粪便排泄的尿酸近似于机体尿酸排泄的总量，Kunming-DY大鼠的尿液和粪便尿酸排泄之和也明显增加。

有意思的是，在Kunming-DY大鼠各因素的相关性分析中可以看到，SUA与进食因素存在负相关。这似乎说明，机体内的尿酸主要来自内源性代谢，进食减少可能会使机体自身细胞更替加快反而导致SUA升高。进一步研究发现，Kunming-DY大鼠禁食36 h，血尿酸明显升高，野生大鼠禁食后也可以观察到该现象。比如，本研究中的野生型雄性大鼠SUA为（11.57±3.63）μg/mL，而禁食36 h但不禁饮的大鼠血尿酸可以升至（20.93±6.98）μg/mL[16]。此结果表明禁食或节食并不是降尿酸的有效措施。特别地，本研究还发现，SUA与体质量存在负相关，该现象与现有临床观察不符。该现象的出现，可能与本研究采用的均为45日龄大鼠有关，因为45日龄的Kunming-DY大鼠体质量约为200 g，远小于Kunming-DY大鼠成年后的稳定体质量（约500 g）。在大鼠体质量上升期，体质量的增加说明同化作用大于异化作用，而内源性尿酸主要是异化作用过程中产生的[17]。

Kunming-DY大鼠生长减缓，饮食却明显增加，血尿酸水平明显升高与人类血尿酸水平相似，存在轻度的肾功能损伤，这些结果表明尿酸酶缺失对大鼠的健康产生了负面影响。同时，Kunming-DY大鼠的血尿酸升高主要是内源性尿酸生成增多所致，尿液和粪便的尿酸排泄量会代偿性增加。