超声波提取马蔺籽油的脂肪酸组成及其抗氧化能力评价

栾真杰 李佩佩 皮 立 李 朵 孟晓萍 孙 菁

(青海省青藏高原特色生物资源研究重点实验室；中国科学院西北高原生物研究所 1，西宁 810008) (中国科学院大学2，北京 100049)

马蔺植物[IrislacteaPall.var.chinensis(Fisch.) Koidz.][1]为我国的广布种，在20个省均有分布，具有较大的野生资源量。其成熟果实为马蔺籽，又名蠡实，收录于《本草纲目》草部，主治寒疝诸疾、喉痹等症。蒙藏医理论认为，马蔺籽主治胃痉挛、烫伤、阑尾炎、身目发黄等症[2，3]，具有较高的药用价值。通过对马蔺籽的显微特征进行研究，发现马蔺种仁部分含有大量油细胞[4]，其含油量在3%～12%，经药理实验证明对小鼠无毒，主要含有亚油酸及油酸[5,6]，这些活性成分具有抗菌、降低血清胆固醇、预防和治疗高血压及动脉粥样硬化症、冠心病等作用[7-9]。

目前，对马蔺籽的研究主要集中于种皮部位，尤其是自马蔺籽种皮中提取的马蔺子素及其相关制剂已收载于我国新药转正标准。而占比较大的种仁部分则相对研究较少，利用程度低，造成了大量的资源浪费。因此，有必要对其马蔺籽油进行深入研究。本研究以马蔺籽为原料，在单因素实验的基础上采用响应面法优化马蔺籽油超声提取工艺条件；用气相色谱-质谱联用法分析马蔺籽油中的脂肪酸组成及相对含量；同时结合DPPH自由基清除法和还原铁/抗氧化能力法对其抗氧化活性进行研究，以期为马蔺籽资源的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马蔺籽购自药材市场，经中国科学院西北高原研究所卢学峰研究员鉴定为鸢尾科鸢尾属植物马蔺[IrislacteaPall. var.chinensis(Fisch.) Koidz.]的干燥成熟果实，所购种子颗粒饱满、无霉变，存放于中国科学院西北高原生物研究所。石油醚(60～90 ℃)、氢氧化钾、甲醇、三氟化硼等均为分析纯。

总抗氧化能力(T-AOC)测试盒(A015-2 ABTS快速法 100T)、总抗氧化能力(T-AOC)测试盒(A015-3 FRAP法 100T)、DPPH、抗坏血酸。

1.2 主要仪器

Thermo 1300/8000Evo气相色谱-质谱联用仪；Eppendorf 5810R离心机；Epoch2微孔板分光光度计；HH-6型数显恒温水浴锅；N-1100旋转蒸发仪；电热鼓风干燥箱；SHB-Ⅲ循环水真空泵；KQ5200DE型数控超声波清洗器；YB-700多功能粉碎机；ZFJ-200中草药粉碎机。

1.3 马蔺籽油超声提取条件优化

1.3.1 原料预处理

筛除马蔺籽中的碎壳、残叶等杂质，然后将马蔺籽置于50 ℃烘箱中烘干至恒重。用多功能粉碎机碎皮后过20目筛，除去马蔺籽种皮，得到马蔺籽种仁。将种仁用粉碎机粉碎后过40目筛，装于自封袋中4 ℃冷藏备用。

1.3.2 提取工艺流程

马蔺籽→除杂→烘干→脱去种皮→粉碎→过筛→超声提取→离心→减压蒸馏→干燥→马蔺籽油→称重。

称取马蔺籽种仁粉10.00 g，以石油醚为溶剂，在一定条件下进行超声提取，离心得到石油醚提取液，40 ℃条件下旋蒸，除尽溶剂，置于电热鼓风干燥箱中干燥至恒重，得马蔺籽油，称重，按照公式计算马蔺籽油得率[10]。

式中:m为马蔺籽的质量/g，m2为空瓶质量；m1为空瓶和马蔺籽油的质量。

1.3.3 响应面优化实验设计

单因素实验：按照1.3.2中的超声提取方法，超声温度30 ℃、超声功率200 W、液料比9 mL/g，考察超声时间(10、20、30、40、50、60、70 min)对出油率的影响；超声时间30 min、超声功率200 W、液料比9 mL/g，考察超声温度(30、40、50、60、70 ℃)对出油率的影响；超声温度30 ℃、超声功率200 W、超声时间30 min，考察液料比(3、6、9、12、15、18 mL/g)对出油率的影响。

响应面实验：根据超声处理温度、时间、功率及液料比四个单因素实验结果，筛选对马蔺籽油得率较为显著的因素作为考察目标，确定响应面实验因素水平。以马蔺籽油得率为响应值，用Design-Expert软件，选用Box-Behnken方法随超声提取工艺进行优化。

1.4 马蔺籽油脂肪酸组成分析

1.4.1 马蔺籽油的甲酯化

参照GB 5009.168—2016的方法，称取马蔺籽油0.1 g于100 mL平底烧瓶中，加入8 mL 2%氢氧化钾—甲醇溶液，在80 ℃水浴上回流直至油滴消失，从回流冷凝器上端加入7 mL 15%三氟化硼甲醇溶液，继续回流2 min，冷却至室温，准确加入10 mL正庚烷振摇2 min，再加入饱和氯化钠溶液振摇静置分层，吸取上层正庚烷提取液5 mL于试管中，加入约3～5 g无水硫酸钠，振摇1 min，静置5 min，吸取上层溶液到进样瓶中待测定。

1.4.2 GC-MS条件

用GC-MS法对马蔺籽油脂肪酸成分进行分析，采用面积归一化法处理数据，并通过检索Nist14数据库和人工解谱的方法，分析图谱中的主要成分。

分析条件：毛细管色谱柱为安捷伦DB-FFPA柱(100 m×0.25 mm ID，0.25 μm)；进样口温度280 ℃；载气为氦气；进样量1 μL；分流比20∶1；程序升温50 ℃保持1 min，以25 ℃/min升温至175 ℃，再以4 ℃/min升温至230 ℃，保持5 min；电离方式为电子轰击离子源(EI)；柱头压力230 kPa；传输线温度280 ℃。

1.5 马蔺籽油抗氧化能力测定

1.5.1 DPPH·清除能力测定

参考Ardestani等[11，12]的方法分别取不同质量浓度的马蔺籽油溶液2 mL，各加入0.2 mmol/mL的DPPH-乙醇溶液2 mL，混合均匀，于常温下避光反应30 min，517 nm波长处测吸光度(As)，以无水乙醇为空白对照(Ab)，以VC为阳性对照，按公式计算DPPH的清除率。

根据不同质量浓度马蔺籽油的清除率，结合SPSS 25.0数据处理软件，计算出对DPPH自由基清除率为50%时所需的溶液质量浓度(IC50)，以IC50值表示马蔺籽油清除DPPH自由基的能力，IC50值越小，表示清除能力越强。

1.5.2 FRAP法测定抗氧化活性

按照总抗氧化能力检测试剂盒(A015-3 FRAP法)说明书制备工作液，37 ℃水浴30 min，依次加入空白对照水和不同浓度的马蔺籽油溶液，室温反应6 min，测定反应液在593 nm处的吸光度，每个样品重复3次。

以FeSO4·7H2O为标准物质，分别配制浓度为0.15、0.30、0.60、0.90、1.20、1.50 mmol/L的溶液，以标准品OD值为横坐标，各OD值对应的标准品浓度为纵坐标，制成标准曲线，将样品OD值代入，计算提取后的溶液与某个摩尔浓度标准品FeSO4抑制率相同，用该浓度下FeSO4的摩尔浓度表示。

1.6 统计方法及分析软件

所有指标均重复测定3次并求取平均值，用Origin 2018软件作图；用SPSS 25.0进行数据统计分析；响应面分析用Design-Expert 11软件进行。

2 结果与分析

2.1 提取条件优化结果

2.1.1 单因素实验结果

预实验中发现，超声功率为100～500 W时，其对马蔺籽油得率有一定影响，但没有显著性(P>0.05)差异，因此，单因素实验固定超声功率为200 W。图1为不同单因素对马蔺籽油得率的影响。

超声时间的影响：由图1可以看出，在10～50 min时，马蔺籽油得率随提取时间的延长不断提高，且增长速度很快，而在50～70 min时，马蔺籽油得率略有下降。可能由于超声波具有强烈的压力、剪切力和温度梯度，长时间的超声会破坏油脂分子结构[13]，导致籽油得率下降。综合考虑，选择提取时间30～70 min进行响应面实验。

超声温度的影响：由图1可知，当提取温度在30～50 ℃时，马蔺籽油得率随着提取温度的升高迅速增大，可能是温度的升高增加了溶剂分子和油脂分子的动能而有利于油脂分子的扩散；但是当提取温度在50～70 ℃时，马蔺籽油得率却显著下降。可能是因为当温度达到石油醚沸程时石油醚在超声的环境中挥发速度过快，造成其液料比降低，难以充分提取马蔺籽油[14]，并且可能带走部分已经溶解的籽油，造成其得率有所下降。因此选择30～70 ℃进行响应面实验。

液料比的影响：通常情况下，较大的溶剂体积由于拥有更高的浓度差，可以更有效地溶解成分，从而提高提取产率[15]。由图1可见，马蔺籽油得率在液料比为3～9 mL/g时，随液料比增加而逐渐增大，当液料比超过9 mL/g时，马蔺籽油得率上升趋势变缓逐渐趋于平衡。其原因可能是当溶剂量已经充分完成提马蔺籽油的条件时，马蔺籽油得率趋于平衡。综合考虑，选择液料比3～15 mL/g进行响应面实验。

图1 不同单因素对马蔺籽油得率的影响

2.1.2 响应面优化实验

在单因素实验的基础上，确定提取时间、提取温度和液料比3个因素，以马蔺籽油(Y)为响应值，采用Box-Behnken实验对马蔺籽油提取工艺进行优化。因素水平见表1，响应面实验设计及结果见表2，回归模型方差分析见表3。

表1 响应面实验因素水平

表2 响应面实验设计及结果

表3 回归模型方差分析

注：*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。

采用 Design-Expert 11数据分析软件对表2中的实验结果进行回归拟合，回归分析结果见表3。由表3可以看出，在所选取的各因素水平范围内，A(液料比)、B(超声时间)、C(超声温度)对应的P值均小于0.01，说明这3个因素对马蔺籽油得率的影响极显著，AB、AC、BC所对应的P值均小于0.01，说明各个因素之间两两交互作用明显。3个因素对马蔺籽油得率的影响顺序为提取温度≈料液比>提取时间。

拟合回归方程为：Y=9.7+1.41A-0.30B-0.67C+0.38AB+0.36AC-0.36BC-1.05A2-0.22B2+0.11C2。

2.1.3 最佳工艺验证实验

经响应面回归分析得到的最优提取工艺条件为提取时间64.021 min、提取温度30.000 ℃、液料比12.784 mL/g，在此条件下马蔺籽油得率的理论值达到10.78%。考虑到实际操作，将最佳工艺条件修正为提取时间64 min、提取温度30 ℃、液料比12 mL/g。在最佳条件下进行5次验证实验，马蔺籽油得率均值为10.56%，与理论值相对误差为1.99%，说明Box-Behnken设计响应面法得到的提取条件相对可靠。

2.2 马蔺籽油脂肪酸组成及含量分析

将所得马蔺籽油甲酯化后，进行GC-MS分析。马蔺籽油主要脂肪酸组成及相对含量见图2和表4。超声提取条件下的马蔺籽油主要含有19种脂肪酸成分，其中饱和脂肪酸主要为棕榈酸(7.75%)及硬脂酸(2.73%)；不饱和脂肪酸主要为亚油酸(41.57%)和油酸(38.96%)。不饱和脂肪酸占比达85%左右。其脂肪酸组成及质量分数与芝麻油极为相似[16]，棕榈酸7.9%～12.0%；硬脂酸4.5%～6.7%；油酸34.4%～45.5%；亚油酸36.9%～47.9%；亚麻酸0.2%～1.0%；花生酸0.3%～0.7%。含量最高的亚油酸(LA)是功能性多不饱和脂肪酸(PUFA)中被最早认识的一种，是必需脂肪酸(EFA)[8]，具有降低血清胆固醇水平作用，摄入大量亚油酸对高甘油三酯疾病有明显的疗效。我国2015版《药典》仍采用亚油酸乙酯丸剂、滴剂作为预防和治疗高血压及动脉粥样硬化症、冠心病的药物。此外，亚油酸还是ω-6长链多不饱和脂肪酸，尤其是γ-亚麻酸和花生四烯酸的前体[9]。因此，可以考虑将马蔺籽油作为功能性油脂开发利用。

图2 马蔺籽油脂肪酸总离子流图

表4 马蔺籽油中主要脂肪酸组成及相对含量

2.3 马蔺籽油的体外抗氧化能力

2.3.1 马蔺籽油清除DPPH自由基的能力

DPPH自由基是一种稳定的自由基，其广泛用于评估油脂的自由基清除活性[17]。由图3可知，马蔺籽油有较好的清除DPPH自由基的活性，且清除率随质量浓度的增加而增大，呈现较好的量效关系。以VC为参照，随着样品质量浓度的增加，DPPH·的清除率逐渐增加，在质量浓度达28 mg/mL时，清除率达61.12%。用SPSS 25计算IC50值为20 mg/mL。

图3 马蔺籽油对DPPH自由基的清除能力

2.3.2 马蔺籽油的Fe3+还原能力

测定马蔺籽油对Fe3+的还原力，本质是对其供电子能力进行检验。理论上，还原力强的物质能更好地提供电子，样品抗氧化能力的强弱可由其还原能力的大小间接反映出来。由图4可知，不同质量浓度的马蔺籽油和对Fe3+均具有一定的还原能力，且随着质量浓度的提高，还原力呈现上升趋势，当质量浓度达到280 mg/mL时，还原率趋于稳定，为32.28%。

以FeSO4·7H2O吸光度值为横坐标，对应的浓度为纵坐标，用Origin软件作出标准曲线为：y=3.162 2x-0.365 5，相关系数r=0.997 0，R2=0.993 9。将样品OD值代入求得样品总抗氧化能力为0.251 1 mmol/L FeSO4·7H2O。

图4 Fe3+的还原能力标准曲线

3 结论

在单因素实验的基础上，运用响应面设计的理论与方法，确定了超声提取马蔺籽油最佳工艺条件为：提取时间64 min、提取温度30 ℃、提取功率200 W、液料比12 mL/g。在此条件下，马蔺籽油得率为10.56%。响应面分析结果显示，4个因素对马蔺籽油得率的影响顺序为：提取温度≈液料比>提取时间>提取功率，其中液料比及提取温度影响达到极显著水平，提取时间影响达到显著水平。本结果可以为马蔺籽油的开发利用提供参考和指导。

马蔺籽油中饱和脂肪酸主要为棕榈酸及硬脂酸；不饱和脂肪酸主要为亚油酸和油酸，不饱和脂肪酸占比81.55%。马蔺籽油具有良好的抗氧化活性，DPPH自由基清除率达61.12%，FRAP法测定其总抗氧化能力为0.251 1 mmol/L FeSO4·7H2O，可以考虑作为功能性油脂产品开发利用。