腹腔镜辅助D2根治性全胃切除术联合DC-CIK治疗胃癌及对血清CA19-9、SRF的影响

杨晓晔，豆发福，李 恒

(三二〇一医院胃肠外科，陕西 汉中 723000)

中晚期胃癌(gastric cancer)患者术后复发率高，同时预后较差[1]。近年来免疫治疗是肿瘤治疗的研究热点，如DC-CIK细胞输注疗法可以改善接受化疗治疗的胃癌效果和预后[2]，但是国内极少关于DC-CIK疗法联合全胃切除术的治疗的研究。糖类抗原19-9(Carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)作为一种肿瘤标志物(Tumor Marker)具有帮助诊断恶性肿瘤、帮助判断患者肿瘤严重程度，具有帮助判断胃癌预后的作用[3]。血清应答因子(serum response factor，SRF)与肿瘤的血管生成、肿瘤细胞的迁移和侵袭有关[4]，但是否与胃癌发病有关，报道尚较少。本研究拟探讨腹腔镜辅助D2根治性全胃切除术联合DC-CIK细胞输注疗法对中晚期胃癌的临床疗效，进一步检测和分析其对血清CA19-9和组织中SRF的水平。

1 资料与方法

1.1 一般资料

经本院伦理委员会批准，选择2016年4月至2017年4月间于本院进行诊断治疗的胃癌患者90例作为研究对象，男57例，女33例，年龄40～75岁。将以上患者按照随机数表法分为两组，对照组给予腹腔镜辅助D2根治术治疗，观察组在对照组基础上联合DC-CIK治疗，每组45例。

对照组男29例，女16例，年龄39～74岁，平均(59.32±3.95)岁，TNM分期Ⅱ期19例，Ⅲ期26例；观察组男28例，女17例，年龄39～74岁，平均(58.67±4.03)岁，TNM分期Ⅱ期17例，Ⅲ期28例。两组的一般资料无显著差异，具有可比性。

1.2 纳入和排除标准

纳入标准：(1)年龄在18～75岁之间；(2)经病理学检测确诊为胃癌并且符合可接受全胃切除术治疗的标准[5]；(3)预计生存期大于3个月；(4)资料完整；(5)签署临床研究研究知情同意书。

排除标准：(1)非首次确诊且为原发性胃癌；(2)合并其他原发性肿瘤；(3)接受过放疗、化疗等治疗；(4)合并其他脏器或消化系统严重疾病；(5)合并免疫系统疾病。

1.3 腹腔镜辅助D2根治术

建立治疗小组，均由具有多年临床经验的医师组成，两组患者均由治疗小组完成。对照组和观察组患者均接受，患者采取平卧位，进行全身麻醉，行脐孔穿刺，建立人工气腹压，术中患者的气腹压维持在2.0 kPa之间。经脐孔置入10 mm套管针与镜头，探查腹腔，于腹腔外侧下左侧腋前线肋缘下2 cm处作主切口和辅助操作孔，之后置入器械。分别于患者的脐横线交点偏上2 cm、右侧前线肋缘下2 cm处、右侧锁骨中线2 cm处分别做3个规格为5 mm的辅操作孔，采取超声刀将胃结肠韧带、大网膜、脾胃韧带切断，使相关动静脉游离，同时依次切断肝胃韧带以及胃部右动静脉，直到全胃游离，探查腹腔并明确肿瘤的相关情况，行D2淋巴结清扫。腹腔镜下全胃切除术的区域清扫主要是将结肠系膜前叶包膜剥离，将胃幽门上小网膜及胃体大弯网膜的血管及韧带进行分离，再对胃大弯脾门处、胃幽门上小网膜处、胃窦幽门下、胃体大弯网膜处、胰腺上缘淋巴结数目进行清扫。腹部正中作长约6～8 cm辅助切口，进入腹腔内，将十二指肠残端切断，进行远端胃切除操作，并采取毕Ⅰ/Ⅱ式吻合术。清洗腹腔后置入引流管，关闭腹腔结束手术。

1.4 DC-CIK细胞免疫细胞的制备

通过参考文献[6]制备DC细胞核CIK细胞。在术前抽取外周全血100 mL，经梯度离心分离单核细胞，将细胞在RPMI 1640培养基中培养，培养条件为于37 ℃，5%的CO2，培养相关试剂购自GIBCO公司(USA)。在培养的第一天在培养基中加入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF，75 ng/mL)和重组人白细胞介素4(rhIL-4，50 ng/mL)，在第四天加入肿瘤抗原(40 μg/mL)在第5天加入肿瘤坏死因子(TNF-α，50 mg/mL)，在第7天收获抗原负载成熟的DC细胞。收集非贴壁细胞并将细胞稀释为1×106个/mL，加入γ-干扰素(1000 U/mL)和重组人白细胞介素2(rhIL-2，1 000 U/mL)，并每隔3天加入rhIL-2(2 500 U/mL)，在第10天和第12天收获CIK细胞。所有细胞均经过流式细胞术检测，并在注射前进行病毒、细菌、真菌和支原体检测为阴性。在术后第一个疗程腹股沟淋巴结周围区皮下注射DC-CIK细胞，每次不少于1×1010个细胞，12天为一个疗程，进行2～3个疗程。

1.5 T细胞亚群的测定

分别在治疗前和治疗后1个月抽取外周静脉血10 mL，其中5 mL使用流式细胞术检测外周血中T细胞亚群，包括CD3+、CD4+、CD8+以及CD4+/CD8+。流式细胞仪为美国Becton Dickerson，SanJose，使用公司配套试剂盒，严格按照说明书方法操作；

1.6 Western blot检测胃癌组织SRF蛋白的表达

简略步骤：分别在治疗前和治疗后1个月采集胃标本，裂解细胞后，在12 000 rpm，4 ℃下离心15 min收集上清液，使用BCA方法绘制标准曲线以确定蛋白质浓度。使用10%的SDS-PAGE凝胶并用于电泳，电泳后使用PVDF膜进行转膜(Bio-Rad，USA)并在室温下用5%无脂牛奶封闭2h。加入一抗室温震荡2 h，后在4 ℃孵育过夜，加入二抗，室温下孵育1.5～2 h，使用ECL试剂(Huiying，Shanghai，China)进行化学发光检测。使用GAPDH作为内参。相关试剂均购买于美国Abcam公司。

1.7 酶联免疫法(ELISA)检测血清CA19-9

采用酶联免疫法(ELISA)检测检测血清中CA19-9的浓度，将5 mL标本离心取上层血清，该试剂盒购自Cusabio Biotech Co.，Ltd。(中国武汉)。根据说明书加入酶标记试剂和显色剂，并通过加入终止溶液终止反应。通过使用酶标仪(Model 680，Bio-Rad，USA)测定450 nm处的光密度。

1.8 观察临床疗效

两组治疗后根据RECIST标准评价肿瘤结果，包括完全缓解(complete remission,CR)、部分缓解(partial remission,PR)、稳定(stable disease,SD)、进展(progressive disease,PD)，并计算客观缓解率(Objective Response Rate，ORR)=(CR+PR)/总例数×100%。

1.9 复发率及其不良反应

在治疗期间关注患者手术不良反应的发生情况，并及时处理；使用电话随访的方式观察术后6个月和第12个月复发率和了解术后不良反应。

1.10 统计学处理

本研究的数据分析采用spss19.0进行，计数资料以%来表示，采用秩和检验或χ2检验比较，计量资料以均数±标准差进行正态分布检验，组间两两比较使用t检验，统计结果以P<0.05视为具有统计学差异。

2 结 果

2.1 两组临床疗效比较

两组的临床疗效有显著差异，观察组的治疗ORR显著高于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 两组临床疗效比较 (例，%)

与对照组相比，aP<0.05(n=45)

2.2 两组T细胞亚群比较

术前三组的T细胞亚群分布无显著差异(P>0.05)，术后1个月后均显著改善(P<0.05)，术后观察组的CD3+、CD4+以及CD4+/CD8+显著高于对照组，CD8+显著低于对照组(P<0.05)，见表2。

表2 两组T细胞亚群比较

与对照组相比，aP<0.05(n=45)

2.3 两组血清CA 19-9比较

治疗前两组血清CA 19-9无显著差异(P>0.05)，治疗后均显著降低(P<0.05)，治疗后观察组的血清CA 19-9显著低于对照组(P<0.05)，见表3。

表3 两组血清CA 19-9比较 (U/mL)

与对照组相比，aP<0.05(n=45)

2.4 两组组织SRF水平比较

治疗前两组组织SRF蛋白相对表达量无显著差异(P>0.05)，治疗后均显著降低(P<0.05)，治疗后观察组的组织SRF蛋白相对表达量显著低于对照组(P<0.05)，见表4。

表4 两组组织SRF蛋白相对表达量比较

与对照组相比，aP<0.05(n=45)

2.5 两组不良反应及复发情况比较

观察组无高热、胸闷、过敏和休克等不良反应出现，有5例低热，经物理降温治疗后恢复，并出现1例一过性寒战，两组不良反应发生情况无显著差差异(P>0.05)。在治疗后1年观察组的复发率显著低于对照组(P<0.05)，见表5。

表5 两组不良反应及复发情况比较 (例,%)

与对照组相比，aP<0.05(n=45)

3 讨 论

肿瘤的过继细胞免疫治疗(adoptive cellular immunotherapy，ACI)主要是利用DC细胞和CIK细胞等对肿瘤进行治疗，是最有前景的治疗方法之一。过往研究结果显示DC-CIK胃癌具有较好治疗效果和预后[7-10]。本次研究结果显示两组的临床疗效有显著差异，观察组的治疗ORR显著高于对照组。观察组无高热、胸闷、过敏和休克等不良反应出现，有5例低热，经物理降温治疗后恢复，并出现1例一过性寒战，两组不良反应发生情况无显著差差异。在治疗后1年观察组的复发率显著低于对照组。单核细胞可通过体外通过GM-CSF等诱导胃DC细胞，DC细胞作为最主要的专职抗原提呈细胞，可通过呈递肿瘤抗原诱导机体产生抗原特异性细胞毒T细胞，从实现杀伤肿瘤细胞的效果[11]。而CIK细胞则会通过分泌细胞因子实现杀伤肿瘤细胞的作用，DC细胞与CIK细胞同时输注具有更好的抗肿瘤作用[12]。等研究也显示DC-CIK疗法可有效提高接受化疗治疗的胃癌患者的临床疗效，有效延长生存期[13]。等研究结果也显示DC-CIK可以调节T细胞亚群，提高预后[14]。这提示DC-CIK联合腹腔镜D2根治性全胃切除术具有更好的临床效果，可减少术后的复发率，并具有一定的安全性。

研究认为胃癌的发生和发展与机体免疫功能失调密切相关，肿瘤细胞也存在免疫逃逸机制，使肿瘤免于被机体清除[15]。并且胃癌患者往往存在营养不良的情况，这也会使机体的免疫力下降，不但会影响肿瘤的复发，也会影响预后[16]。CA19-9是较为敏感的胃癌的标志因子，许多研究已经表明CA19-9不但可以反映胃癌的严重程度，还可以对预后进行判断[17]。本次研究结果显示术前三组的T细胞亚群分布无显著差异，术后1个月后均显著改善，术后观察组的CD3+、CD4+以及CD4+/CD8+显著高于对照组，CD8+显著低于对照组。治疗前两组血清CA 19-9无显著差异(P>0.05)，治疗后均显著降低，治疗后观察组的血清CA 19-9显著低于对照组。这说明DC-CIK方法可显著的提高胃癌患者的免疫能力，并提高预后。SRF是近年来发现的一种参与肿瘤生长和转移的蛋白，研究表明胃癌组织中的SRF表达水平显著高于癌旁组织，并且SRF可以调节E-cadherin以及β-catenin等的水平调节胃癌细胞的迁移和侵袭过程。本次的研究结果还显示治疗前两组组织SRF蛋白相对表达量无显著差异，治疗后均显著降低，治疗后观察组的组织SRF蛋白相对表达量显著低于对照组。这说明DC-CIK可能通过抑制SRF蛋白水平，降低胃癌细胞的迁移和侵袭能力，从而减少胃癌的术后复发率，提高预后。

综上所述，腹腔镜辅助D2根治性全胃切除术联合DC-CIK对胃癌具有更好的临床效果，可抑制CA19-9、SRF水平。