DADS通过Rac1/LIMK1/cofilin1通路增强沉默LIMK1抑制人胃癌BGC823细胞迁移侵袭

杨邦敏，刘 芳，夏 红，苏 坚,3，苏 波，苏 琦*

(1.湖南省肿瘤细胞与分子病理学重点实验室，湖南省胃癌研究中心，南华大学肿瘤研究所，湖南 衡阳 421001；2.怀化市第一医院，湖南 怀化 418000；3.南华大学附属第二医院病理科，湖南 衡阳 421001)

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，全球发生率与死亡率分别居于第五位与第三位[1]。我国是胃癌高发地区，发生率与死亡率位于第二。胃癌患者往往就诊时已经发生侵袭与转移，治疗效果较差，5年生存率低[1-2]。从而，探讨胃癌侵袭转移机制与治疗靶点非常重要。

研究表明，LIM激酶(LIM kinase, LIMK)通过磷酸化和失活cofilin1调节肌动蛋白聚合，调控肿瘤细胞增殖、细胞周期、侵袭转移等[3]。LIMK1在胃癌中高表达与肿瘤大小、淋巴结转移及TNM分期有关。而沉默LIMK1表达可抑制细胞增殖、迁移和侵袭，在体内可延缓肿瘤生长和腹膜转移，提示LIMK1可能是胃癌治疗的潜在靶点[4]。二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)是大蒜的一种脂溶性有效成分，具有明显抑制肿瘤的作用[5]。作者前期工作证明，沉默LIMK1可抑制人胃癌BGC823细胞迁移侵袭[6]。本文进一步探讨DADS通过Rac1/LIMK1/cofilin1通路对沉默LIMK1抑制BGC823细胞迁移侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人胃癌BGC823细胞由本实验室保存，于含10%小牛血清的RPMI1640培养基中，37 ℃，5%CO2、饱和湿度的培养箱内传代培养。

1.2 主要试剂

LIMK1(Q491)、cofilin1(M1)与p-cofilin1(S3) (Abzoom公司)。ROCK1与PAK1(Epitomics公司)，Rac1(Millipore公司)。Total RNA Kit(Omega公司)，RT reagent kit(TaKaRa公司)，PCR试剂盒(Promega公司)。BCA蛋白定量试剂盒(美国Pierce公司)，ECL发光检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，Transwell小室(Corning公司)，Matrigel(BD公司)。小牛血清(杭州四季青生物工程公司)，RPMI-1640培养基(Gibco公司)。

1.3 划痕实验

调整细胞浓度为1×106/mL，吸1 mL细胞悬液接种于6孔板，每组3个平行样本。RPMI 1640培养液37 ℃、5%CO2培养，直至形成细胞单层。用10 μL Eppendorf Tip在细胞板上划痕，无血清培养液洗3次，加新鲜无血清培养基。镜下测量划痕区距离，实验重复3次。

1.4 侵袭实验

将基质胶稀释液铺置在Transwell小室中，100 μL细胞接种至小室上腔，取500 μL含10%胎牛血清培养液添加至下腔，37 ℃、5%CO2培养24 h后取出，擦弃小室上层细胞并用4%多聚甲醛固定10 min，0.1%结晶祡染色，PBS液洗涤，晾干。镜下随机选取4个高倍视野进行细胞计数，取平均值。每组细胞设3个复孔。

1.5 RT-PCR

RNA试剂盒提取细胞总RNA，AMV酶作用下逆转录合成cDNA。见表1。PCR反应条件：94 ℃，5 min；94 ℃，40 s，Tm，45 s，72 ℃ 1 min 20 s，28个循环；72 ℃ 10 min。5 μL的PCR产物经1%的琼脂糖电泳，嗅化乙啶染色，IS1000图像分析软件读取条带灰度值，相对值以与β-actin灰度值之比表示。

表1 PCR引物序列

1.6 Western blot

收集细胞，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，每组取等量样本进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳后转膜，封闭1 h，加一抗，4 ℃过夜，TBST洗膜，加二抗孵育1 h，洗膜，采用ECL发光法，最后X片曝光、显影、定影。实验重复3次。

1.7 统计学处理

采用统计学软件SPSS13.0对数据进行统计分析：实验重复3次，数据采用均数±标准差，组间区别用t检验分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 DADS对沉默LIMK1抑制BGC823细胞迁移的影响

划痕实验显示，0 h时，各组划痕距离基本相同，12 h和24 h后，沉默组疤痕距离分别为(0.66±0.03)与(0.30±0.09)和较对照组(0.35±0.03)与(0.10±0.03)cm呈时间依赖性显著增加(P<0.05)，而DADS处理沉默组(0.86±0.01)与(0.40±0.01)cm较沉默组明显增加(P<0.05)(图1)。表明沉默LIMK1可抑制BGC823细胞迁移能力，DADS可增强沉默LIMK1的抑制迁移作用。

图1 DADS对LIMK1沉默抑制BGC823细胞迁移的影响与各组0 h比较，*P<0.05；与miR-LIMK1各组BGC823细胞比较，#P<0.05

2.2 DADS对沉默LIMK1抑制BGC823细胞侵袭的影响

侵袭实验显示，沉默组穿膜细胞(35±2.86)明显少于对照组(66±3.56)及空载体组(65±4.35)(P<0.05)。表明沉默LIMK1可抑制BGC823细胞的侵袭能力。并且，DADS处理沉默组穿膜细胞(19±5.07)明显低于沉默组(P<0.05)(图2)。证明DADS增强沉默LIMK1抑制侵袭作用。

图2 DADS对沉默LIMK1抑制BGC823细胞侵袭的影响(200×)与BGC823 and vector比较，*P<0.05；与miR-LIMK1比较，#P<0.05

2.3 DADS及沉默LIMK1对BGC823细胞LIMK1表达的影响

图3显示，沉默组LIMK1 mRNA与蛋白表达明显低于对照组和空载体组，15 mg/L DADS作用24 h后，各处理组明显低于处理前沉默组、对照组和空载体组(P<0.05)。对照组与空载体组相比之间无统计学意义(P<0.05)。表明沉默LIMK1与DADS可下调LIMK1，而DADS可增强沉默LIMK1抑制LIMK1表达效果。

2.4 免疫细胞化学结果

图4显示，LIMK1蛋白在对照组和空载体组细胞浆表达呈强阳性，在沉默组及DADS处理沉默组表达减弱，而DADS处理沉默组更为明显。

2.5 DADS对LIMK1沉默BGC823细胞Rac1蛋白表达的影响

图5显示，沉默组Rac1蛋白表达水平较对照组和空载体组略有降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。对照组和空载体组之间差异无显著性(P>0.05)。而DADS作用LIMK1沉默组、对照组与空载体组后，Rac1表达明显下调(P<0.05)，表明DADS可下调Rac1表达作用。

2.6 DADS对LIMK1沉默BGC823细胞Pak1蛋白表达的影响

图6显示，沉默组Pak1表达水平较对照组和空载体组略有降低，但无统计学意义(P>0.05)。对照组与空载体组无明显差异(P>0.05)。而DADS作用LIMK1沉默组、对照组与空载体组后，Pak1表达明显下调(P<0.05)，表明DADS可抑制Pak1表达。

图3 DADS对LIMK1沉默BGC823细胞LIMK1表达的影响A:RT-PCR; B:Western blot; M:mark; 1:BGC823; 2:BGC823+DADS; 3:vector; 4:vector+DADS; 5:miR-LIMK1; 6:miR-LIMK1+DADS与BGC823 and vector比较，*P<0.05；与BGC823+DADS and vector+DADS比较，#P<0.05;与miR-LIMK1比较，$P<0.05

图4 DADS对LIMK 1沉默BGC823细胞LIMK 1蛋白表达的影响(200×)

图5 DADS对LIMK1沉默BGC823细胞Rac1表达的作用1:BGC823; 2:vector; 3:miR-LIMK1; 4:miR-LIMK1+DADS与BGC823 and vector比较，*P<0.05

图6 DADS对LIMK1沉默BGC823细胞Pak1蛋白表达的作用1:BGC823; 2:vector; 3:miR-LIMK1; 4:miR-LIMK1+DADS与BGC823 and vector比较，*P<0.05

2.7 DADS对LIMK1沉默BGC823细胞RocK1蛋白表达的影响

结果显示(图7)，沉默组Rock1表达水平较对照组和空载体组略有降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。对照组与空载体组差异无显著性(P>0.05)。而DADS作用LIMK1沉默组、对照组与空载体组后，Rock1表达明显下调(P<0.05)，表明DADS可抑制Rock1表达。

图7 DADS对LIMK1沉默BGC823细胞Rock1蛋白表达的作用1:BGC823; 2:vector; 3:miR-LIMK1; 4:miR-LIMK1+DADS与BGC823, vector and miR-LIMK1比较，*P<0.05

2.8 DADS对LIMK1沉默BGC823细胞Cofilin1与p-Cofilin1蛋白表达的影响

结果显示(图8)，各组Cofilin1表达水平差异无显著性(P>0.05)。但是，沉默组p-Cofilin1表达较对照组与空载体组明显降低(P<0.05)，而DADS处理沉默组后p-Cofilin1表达显著降低(P<0.05)。表明沉默LIMK1可抑制Cofilin1磷酸化，DADS能够增强沉默LIMK1失活Cofilin1的作用。

图8 DADS对LIMK1沉默BGC823细胞Cofilin1与p-Cofilin1表达的影响1:BGC823; 2:vector; 3:miR-LIMK1; 4:miR-LIMK1+DADS与BGC823 and vector比较，#P<0.05；与miR-LIMK1比较，*P<0.05

3 讨 论

研究表明，Rac1/LIMK1/cofilin通路在许多疾病中起着一定作用。Tong等[7]报告，多形核中性粒细胞的过度募集和不当激活常导致炎症性疾病。在中性粒细胞中，生理剪切应力诱导c-Abl激酶激活可调节Vav1的活性，进而影响Rac1/PAK1/LIMK1/cofilin通路。Yang等[8]显示，氯化铝可下调Rac1、p-PAK、p-LIMK、p-cofilin，抑制F-actin的聚合灭活Rac1/cofilin通路，导致海马区树突棘的丢失。Lu等[9]报道，黄芩苷可上调SYP、PSD95、BDNF、TrkB表达，激活Rac1-LIMK1-cofilin通路，提高突触可塑性，明显减轻抑郁样行为改变。

本研究结果显示，沉默LIMK1可显著抑制BGC823细胞迁移与侵袭，而DADS处理沉默组更为明显。沉默组LIMK1 mRNA与蛋白表达明显降低，DADS处理后，各组明显低于处理前。LIMK1蛋白在对照组和空载体组细胞浆表达呈强阳性，在沉默组及DADS处理沉默组表达减弱，而DADS处理沉默组更为明显。DADS作用后，沉默组、对照组和空载体组的Rac1、Rock1、Pak1与p-cofilin1表达均下调。表明DADS可通过阻断Rac1/LIMK1/cofilin1通路增强沉默LIMK1抑制BGC823细胞迁移侵袭。

最近研究表明，HCC中长链非编码RNA的分化拮抗非蛋白编码RNA(long non-coding RNA differentiation antagonizing nonprotein coding RNA，DANCR)高表达，促进肝癌细胞的增殖和转移，而沉默DANCR可抑制移植瘤生长。DANCR作为ceRNA通过诱骗miR-27a-3p调节ROCK1/LIMK1/Cofilin1通路，促进HCC的发展与EMT[10]。Liao等[4]报告，LIMK1高表达通过激活体外PI3K/Akt信号通路促进上皮间质转化与结直肠癌(CRC)移植瘤的生长和转移，显著增加细胞的增殖和迁移，而沉默LIMK1效果相反，表明LIMK1在促进CRC的进展起着关键作用。研究显示，SSH3通过与LIMK1/Rac1的相互作用，调控参与细胞骨架信号通路的肌动蛋白的重构，进而促进CRC细胞的侵袭转移[11]。ROCK1和ROCK2可促进前列腺癌细胞PC-3和DU145细胞的增殖与迁移侵袭，沉默ROCK1和ROCK2可下调p-LIMK1和MMP-2表达，抑制前列腺癌细胞增殖和迁移[12]。Zhao等[13]发现，miR-128-3p可靶向LIMK1调控LIMK1/CFL1通路抑制乳腺癌的进展。miR-138可显著下调LIMK1与降低cofilin活性，抑制非小细胞肺癌(NSCLC)细胞的迁移和侵袭，而LIMK1高表达的作用相反，提示miR-138可能通过靶向LIMK1/cofilin通路抑制NSCLC细胞的迁移和侵袭[14]。在口腔鳞状细胞癌(OSCC)，miR-106a可直接靶向LIMK1抑制OSCC细胞的增殖与EMT[15]。Yu等[16]发现，miR-384可靶向并负调控LIMK1阻断LIMK1/cofilin通路，抑制细胞增殖、侵袭、细胞周期、LNM与肿瘤生长和促进凋亡。

目前，研发LIMK/cofilin通路的抑制剂或药物成为肿瘤治疗的新途径。Kang等显示，骨桥蛋白(osteopontin, OPN)可促进NSCLC细胞迁移和侵袭。而从药用植物白花梅根中分离的抗癌活性成分Plumbagin可可通过ROCK/LIMK/cofilin通路抑制OPN诱导的NSCLC细胞侵袭和体内肺转移[17]。研究发现，小分子化合物LC-0882可阻断PAK4/LIMK1/cofilin通路抑制胃癌细胞的增殖与侵袭[18]。从草药分离出曲霉醇可降低LIMK1活性和p-cofilin1抑制乳腺癌细胞迁移与F-actin聚合[19]。从苦参根中提取苦参碱下调EGFR磷酸化通过抑制EGFR/Cyclin D1/CDK4/6、EGFR/Akt和MEK-1/ERK1/2/MMP2通路，下调p-LIMK1和p-Cofilin抑制胃癌细胞迁移侵袭[20]。我们先前采用蛋白质组学技术鉴定DADS作用胃癌细胞的靶点，发现LIMK1下调[21]。并且，DADS通过Rac1-ROCK1/PAK1-LIMK1/cofilin通路下调Rac1、ROCK1、PAK1、LIMK1与destrin以及p-LIMK1与p-cofilin 1，抑制结肠癌SW480细胞迁移与侵袭和裸鼠移植瘤生长[22-23]。DADS通过抑制PI3K/Akt通路抑制Rac1的表达和活性，从而抑制EMT和结肠癌细胞的迁移侵袭。进一步发现DADS通过靶向Rac1介导PAK1-LIMK1-Cofilins信号通路阻断EMT[24]。本研究结果证实，DADS可通过阻断Rac1/LIMK1/cofilin1通路增强沉默LIMK1抑制BGC823细胞迁移侵袭，表明Rac1可能是DADS抑制胃癌细胞侵袭的靶分子。