选择性剪接与细胞凋亡

黎权文，李全忠

（桂林医学院附属医院心血管内科，广西 桂林）

0 引言

凋亡定义为单个细胞破碎成膜结合颗粒，表现为DNA 片段化、胞质和核浓缩、染色质浓缩、凋亡小体形成，然后被特殊的吞噬细胞如巨噬细胞和嗜中性粒细胞吞噬。凋亡有助于机体去除感染、受损、老化或危险的细胞，从而限制周围组织的破坏，并维持组织的动态平衡和器官的正常发育。凋亡的紊乱与自身免疫、慢性炎症性疾病、肿瘤直接相关。

真核生物中，选择性剪接（alternative splicing，AS）发生在基因转录后，使单个基因产生一个以上的转录本[1]。通过AS，同一基因产生的不同的mRNA 转录本，经翻译形成的蛋白质可能在结构、功能、活性等方面存在明显差异[2]。这种差异，造就了蛋白质的多样性及物种的复杂性。对AS 的研究逐渐深入，已经从单个剪接事件发展到描述全局的剪接网，着重强调它们如何进行分子协调。现已确定，AS 有助于细胞分化、组织和器官发育[3]。而全基因组研究估计人类90-95%的基因经历不同程度的AS[3,4]。同时，前体mRNA 中顺式作用的序列元件、反式作用的剪接因子或剪接体其他成分的突变引起人类多种疾病，进一步凸显了AS 的生物学重要性[5]。本综述介绍AS 生理学基础及调控机制，同时还探讨了AS 事件与凋亡的关系。

1 AS 的生物学基础

真核生物基因序列中含有多个外显子及内含子，然而成熟的mRNA 只含有外显子序列信息，这种将前体mRNA 剪接加工去除内含子形成成熟mRNA 的现象称为选择性剪接（alternative splicing，AS）。剪接位点选择的改变直接影响遗传序列，导致蛋白质一级结构序列改变，最终将可能影响蛋白质的变构调节、酶活性或配体结合。剪接因子识别并结合顺式作用调控序列，是建立和维持AS 的基本机制。这些顺式作用调控序列包括外显子增强子、外显子沉默子、内含子增强子和内含子沉默子。剪接因子与顺式作用调控序列的识别机制复杂而精密，大体上分为RNA-蛋白质识别、RNA-RNA 识别和基因调控的特异性位点识别。

剪接体是一种高度动态的核糖核蛋白复合体，由小的核糖核蛋白颗粒U1、U2、U4/U6 和U5 组成。它精密的组装与分解直接影响剪接作用，是AS 的执行者[6]。在识别剪接位点后，剪接体集合并组装成剪接复合体完成AS，其机制主要包括：（1）剪接体U1、U2 与前体mRNA 上的剪接位点结合，并形成前剪接体复合体A[7]；（2）snRNP 将U4/U6、U5 转运至剪接位点，与前剪接体复合体A 形成前剪接体复合体B[8,9]；（3）U1、U4 脱离，U2、U5、U6 形成具有催化活性的剪接体复合物C[10,11]，最终执行AS（图1）。

2 AS 的调控

AS 受顺式作用调控序列和反式作用因子。反式作用因子包括富含丝氨酸/精氨酸（SR）的蛋白家族、异源核糖核蛋白（hnRNPs）家族和组织特异性RNA 结合蛋白。反式作用因子识别并结合顺式作用调控序列，促进或抑制AS，是AS 的基本调控方式[12]。这些顺式作用调控序列和反式作用因子的多重作用和作用机理已得到广泛研究，但是实际上更为复杂。因为剪接与转录相关，并且调节转录的因子也直接影响AS[13]。其次，基因的转录与前体mRNA 的AS 存在时间及空间上的交错。真核生物基因转录编码形成mRNA 由RNA 聚合酶II（RNA polymerase II，RNAPII）执行。进一步研究表明，RNAPII 在AS 中至关重要，其羧基端结构域对剪接因子聚集到转录位置是必不可少的[14]。RNAPII 的延伸速率直接影响转录过程中新生前体mRNA 的剪接位点和顺式作用调控序列出现的速度。RNAPII 延伸减慢或暂停，有利于促进外显子包含；反之，则有利于促进外显子跳跃。最后，在基因转录过程中，核小体不可避免的阻碍RNAPII 的延伸，这种方式有利于剪接因子的识别并促进外显子包含[15]。组蛋白高乙酰化与共转录剪接调控相关，其通过增加或减少剪接因子的募集而调控AS；同时组蛋白高乙酰化可导致局部RNAPII 延伸率增加，促进外显子跳跃。组蛋白标记也可以对AS 造成直接的影响，因为某些组蛋白修饰会通过染色质结合蛋白募集剪接因子[16]。甲基结合域蛋白募集组蛋白修饰酶来改变周围的染色质，干扰RNAPII的延伸率。DNA 甲基化可能通过改变染色质或RNAPII 的延伸率影响AS。这些说明，表观遗传学也直接影响AS。

3 AS 与凋亡

3.1 剪接体核心成分与凋亡

mRNA 前体加工因子（pre-mRNA processing factor，PRPF）是剪接体核心成分。PRPF8 氨基酸序列437-770 结构域结合U5[17]，同时羧基端激活U4/U6 的解旋酶[18]。PRPF8 突变引起细胞凋亡导致神经变性[19]。PRPF4 是U4/U6 的核心蛋白，能通过p38 MAPK 信号通路抑制乳腺癌细胞凋亡[20]。PRPF3 与PRPF4相互作用，共同维持snRNP 结构稳定[21]。Comitato A 等研究发现，突变的PRPF3 聚集在核仁内大的聚集物中，影响了SRSF2 的定位，触发光感受器细胞的凋亡[22]。PRPF31 的突变促进RHO 基因外显子3 跳过，降低视紫红质的表达，并导致视紫红质阳性的视网膜细胞凋亡[23]。PRPF40B 定位于富含剪接因子的核斑点，与剪接因子SF1 和U2AF65 结合，调节不同的剪接事件。PRPF40B 的缺失促进Fas 外显子6 的包含，导致长促凋亡Fas 亚型增加，膜结合Fas 受体增加，促进细胞凋亡[24]。

3.2 剪接因子与凋亡

剪接因子主要由SR 蛋白家族和hnRNPs 蛋白家族组成。大多数SR 蛋白与剪接体结合促进剪接体识别外显子，从而促进AS；而hnRNPs 与前体mRNA 的剪接位点结合，阻止剪接体识别剪接位点。SR 蛋白经常与hnRNPs 结合，以浓度依赖的方式拮抗hnRNPs 的作用[25]。剪接因子3b 亚基1（splicing factor 3b subunit 1，SF3B1）是U2 复合体的一个组成成分。Zhang Q 等研究发现，SF3B1 是Tap73 的关键剪接因子，抑制SF3B1 表达能提高Tap73/DNp73 比列，并促进宫颈癌细胞凋亡[26]。hnRNA 蛋白K（Heterogeneous nuclear ribonucleo protein K ，hnRNPK）是MRPL33 前体mRNA 的关键剪接调节因子，促进MRPL33 外显子3 包含，导致MRPL33-L 表达增加，抑制结直肠癌细胞凋亡[27]。富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子/剪接因子2（Serine/arginine rich splicing factor/Splicing factor 2 ，ASF1/SF2）是序列特异性剪接因子。Iwanaga N 等使用促凋亡刺激物处理U937 细胞发现，caspase-2 前体mRNA 外显子9 包含增加，导致caspase-2S/caspase-2L 的比例增加[28]。Jiang ZH 等研究表明ASF1/SF2、剪接因子SC35 促进caspase-2 的外显子9 跳跃，而hnRNP A1 促进外显子9 包含[29]。这表明ASF1/SF2、剪接因子SC35、hnRNP A1共同调节caspase-2 的AS，调控细胞凋亡。

3.3 凋亡基因的AS 与凋亡

凋亡是一种程序性细胞细胞，凋亡的激活表现为促凋亡基因的增加和抗凋亡基因的减少以及caspase 的激活，是一种规律的级联反应。然而，许多凋亡基因的AS 形成不同的亚型，它们在功能上常表现出拮抗作用。

Bcl-x 基因含有3 个外显子，在外显子2 中具有两个5，剪接位点。Bcl-x 基因的AS 中，选择了近端5，剪接位点，则会产生长的Bcl-xL 亚型；而选择了远端5，剪接，则会产生短的Bcl-xS 亚型。Bcl-xL 具有233 个氨基酸，含有BH1、BH2、BH3 和BH4 结构域。Bcl-xL 通过BH1、BH2 结构域与线粒体膜结合，诱导与线粒体膜结合的Bax 向细胞质转移，或者直接与Bax 结合，阻止了tBid 与Bax 结合，防止线粒体外膜持续开发以及细胞色素c 的释放[30]。因此，Bcl-xL 通过抑制线粒体外膜持续开发来抑制细胞凋亡[31]。而Bcl-xS 与Bcl-xL 相比，缺少了63 个氨基酸区段，该区段包含保守的BH1 和BH2 结构域。Bcl-xS 与Bcl-xL 形成异源二聚体，抑制Bcl-xL 的抗凋亡作用。多种剪接因子和信号通路影响Bcl-xL/Bcl-xS 的剪接比，包括SR 蛋白、hnRNP、RNA 结合蛋白和转录因子。PUMA 有PUMA-α，-β，-δ 和-γ 四种不同的 剪 接 变 体[32]。PUMA-α 和-β 都 包 含BH3 域，而PUMA-γ 和PUMA-δ 没有BH3 域。进一步研究表明，PUMA-α 和-β 通过结合BAX 的BH3 结构域，使线粒体外膜通透性改变，释放细胞色素c，从而介导线粒体诱导的细胞凋亡[33]。Bnip3 是一种BH3-only蛋白。Bnip3 基因的AS 产生两种剪接变体，分别为Bnip3FL 和Bnip3Δex3。Bnip3FL 同时具有BH3 和羧基末端跨膜结构域，而Bnip3Δex3 两者均缺失[34]。Bnip3FL 蛋白结构中含有羧基末端跨膜结构域，是Bnip3 进入线粒体执行促凋亡生物功能的基础[35]。Bnip3Δex3 中缺少羧基末端跨膜结构域，表明该剪接体无法将自身插入线粒体膜中。但是Bnip3Δex3 与Bnip3FL 结合形成同源二聚体，防止Bnip3FL 与线粒体膜结合[34]。凋亡基因的AS 受多种因素调控，包括细胞内及细胞外环境因素，其调控机理精密而复杂。以前，由于复杂的分析，较高的成本以及在较旧的、较不敏感的技术中发现的假阳性结果，凋亡基因AS 调控的研究受到限制。但是，随着测序成本的降低和二代测序的出现，凋亡基因AS 的调控机制将得到更深入的认识。

4 总结

AS 是真核生物基因表达调控的关键部分，受多种因素调节，参与真核生物的生长、发育、进化。同时，细胞在各种病理或应激状态下，AS 作用导致基因组表达发生差异性改变以维持细胞的稳态。然而，AS 的调控不仅仅是单一的调控机制，而是复杂精细的调控网。凋亡是在各种病理或应激状态下以适应机体需要而执行的程序性细胞死亡，其与AS 相关的事件足以证明AS 与凋亡直接相关。因此，有必要进一步阐明剪接调控网在凋亡中的级联改变。深入了解凋亡的剪接调控网，将有可能开发出新的治疗靶标，为新的药物研发提供新的思路。