不同单因素对“龙牧801”紫花苜蓿总黄酮提取率的影响

李晨阳，黄明奇，李传峥，刘丹，兰文丽，杨陈晨，李波

不同单因素对“龙牧801”紫花苜蓿总黄酮提取率的影响

李晨阳，黄明奇，李传峥，刘丹，兰文丽，杨陈晨，李波

（齐齐哈尔大学 1. 生命科学与农林学院，2. 抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

以龙牧801苜蓿干粉为材料，采用索式提取法，对影响苜蓿总黄酮提取率的4个单因素的不同水平进行比较，以确定各因素下苜蓿黄酮最大提取率．结果表明，在不同固液比、乙醇体积浓度、浸提时间和浸提温度提取条件下，物料比为1∶30（g/mL），乙醇体积浓度为70%，提取时间为3 h，提取温度为90℃，苜蓿总黄酮提取率可达9.48 mg/g．

龙牧801苜蓿；总黄酮；提取率；单因素

紫花苜蓿（L.）是豆科苜蓿属草本植物，其种植历史悠久，且分布广泛，营养价值丰富，具有“牧草之王”的美称[1]．紫花苜蓿富含多种蛋白质、皂苷类、黄酮类、苜蓿多糖和氨基酸等[2]．黄酮类化合物属于多酚类物质，存在于很多植物尤其是高等植物体内．根据相关实验结果可以发现，黄酮类化合物的生物活性非常强大，具有抗氧化性和抗病毒活性等功能[3-5]．索氏提取法是一种传统的萃取化合物的方法，其基本原理是通过虹吸原理对物质进行多次萃取，从而提高所需化合物的提取率[6]．本研究以紫花苜蓿为原材料，利用索氏提取器，通过单因素实验探究紫花苜蓿中总黄酮提取的最佳工艺条件．

1　材料与方法

1.1　实验材料

以龙牧801苜蓿鲜草作为实验材料，将其置于阴凉通风处风干，再通过粉碎机粉碎制作成干粉，以备实验使用．

1.2　实验方法

1.2.1标准曲线的绘制与回归方程的确立实验依据荆常亮[7]对紫花苜蓿总黄酮提取、纯化及其抗氧化活性研究中的标准曲线绘制方法，称取5 mg芦丁标准品，置于25 mL容量瓶中，用60%的乙醇溶解并定容至25 mL，配制成0.2 mg/mL的芦丁标品溶液备用．采用NaNO2/Al（NO3）3显色法对标品溶液进行显色反应，准确吸取 0，1，2，3，4，5，6 mL 标品溶液于具塞试管中，依次添加60%乙醇（5 mL），5% NaNO2溶液（1 mL），10% Al（NO3）3溶液（1 mL），4%的NaOH溶液（10 mL）．静置15 min后加去离子水定容至25 mL，在 510 nm波长下测量OD值，绘制标准曲线，得标准方程为=0.111-0.005 9（2=0.9973）．

1.2.2固液比对索氏提取苜蓿总黄酮的影响称苜蓿草粉2.00 g，以浸提时间3 h，温度90 ℃，体积浓度为70% 的乙醇为基本提取条件，分别设定1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60 不同固液比提取苜蓿总黄酮，分析固液比对索氏提取紫花苜蓿总黄酮提取率的影响．

1.2.3乙醇体积浓度对索氏提取苜蓿总黄酮的影响称苜蓿草粉2.00 g，以固液比1∶30，浸提时间3 h，浸提温度90℃为基本提取条件，分别用40%，50%，60%，70%，80%，90% 不同乙醇体积浓度提取苜蓿总黄酮，探究不同体积浓度的乙醇对索氏提取紫花苜蓿黄酮提取率的影响．

1.2.4浸提温度对索氏提取苜蓿总黄酮的影响称苜蓿草粉2.00 g，以固液比1∶30，乙醇体积浓度70%，提取时间3 h为基本实验条件，分别采用80，85，90，95℃ 不同温度提取苜蓿总黄酮，探究不同温度对索氏提取苜蓿总黄酮提取率的影响．

1.2.5浸提时间对索氏提取苜蓿总黄酮的影响称苜蓿草粉2.00 g，以固液比1∶30，提取温度90℃，乙醇体积浓度70%为基本提取条件，再分别以2，2.5，3，3.5，4 h 不同浸提时间提取苜蓿总黄酮，探究不同提取时间对索氏提取苜蓿总黄酮提取率的影响．

2　结果与分析

2.1　不同因素对苜蓿总黄酮提取的影响

2.1.1固液比对苜蓿总黄酮提取率的影响在乙醇体积浓度为70%，提取温度为90 ℃，浸提时间3 h的条件下，不同固液比对苜蓿总黄酮提取率的影响见图1．由图1可见，随着乙醇用量的增加，苜蓿总黄酮提取率呈先增后降的趋势，固液比为1∶10时，总黄酮提取率最低为5.606 mg/g；固液比为1∶30时，总黄酮提取率最高为8.218 mg/g．在1∶20，1∶30，1∶40，1∶50的固液比条件下，总黄酮提取率的变化差异不显著（＞0.05），当固液比为1∶60时总黄酮提取率急剧下降，固液比为1∶30时，苜蓿总黄酮提取率达最大值，其总黄酮提取率略高于1∶20，1∶40，1∶50的固液比水平．1∶10，1∶60固液比显著影响苜蓿总黄酮的提取率，综合考虑固液比对苜蓿黄酮提取率的影响，可选择1∶30为本因素的最佳水平．但在1∶20，1∶30固液比条件下对苜蓿总黄酮提取率没有大的差异，因此在为了节约原料前提下，提取苜蓿黄酮也可选择物料比为1∶20．

2.1.2乙醇体积浓度对总黄酮提取率的影响在固液比1∶30，温度90℃，浸提时间3 h为基本提取条件下，不同体积浓度乙醇对苜蓿总黄酮提取率的影响见图2．由图2可见，随着乙醇体积浓度的增加，苜蓿总黄酮提取率呈先增后降的趋势，乙醇体积浓度为40%时，总黄酮提取率最低，为4.142 mg/g；乙醇体积浓度为70%时，总黄酮提取率最高，为8.218 mg/g．乙醇体积浓度过高或过低对苜蓿总黄酮提取率的影响均比较大，在乙醇体积浓度超过70%时，对苜蓿黄酮提取率未达到促进作用，因此可选择体积浓度 70% 的乙醇提取苜蓿总黄酮．

图1　物料比对总黄酮提取率的影响

图2　乙醇体积浓度对总黄酮提取率的影响

2.1.3浸提温度对总黄酮提取率的影响在固液比1∶30，乙醇体积浓度70%，提取时间3 h为基本提取条件下，不同浸提温度对苜蓿总黄酮提取率的影响见图3．由图3可见，随着浸提温度的增加，苜蓿总黄酮提取率呈先增后降的趋势，浸提温度为80℃时，总黄酮提取率最小，为6.597 mg/g；浸提温度为90℃时，总黄酮提取率达到最大值，为8.218 mg/g．当浸提温度再增加时，未能促进总黄酮提取率的增加，因此90 ℃为苜蓿总黄酮浸提温度的最佳水平．

2.1.4浸提时间对总黄酮提取率的影响在固液比1∶30，乙醇体积浓度70%，提取温度90℃为基本提取条件下，不同浸提时间对苜蓿总黄酮提取率的影响见图4．由图4可见，随着浸提时间的增加，苜蓿总黄酮提取率呈先增后降的趋势，浸提时间为2 h时，总黄酮提取率最低为5.516 mg/g；浸提时间为3 h时，总黄酮提取率最大，为8.218 mg/g．当浸提时间超过3.5 h，总黄酮提取率开始下降，说明苜蓿总黄酮提取率未能通过增加浸提时间而增加，因此苜蓿总黄酮浸提3 h为最佳浸提时间．

图3　浸提温度对总黄酮提取率的影响

图4　浸提时间对总黄酮提取率的影响

2.2　验证实验

根据单因素实验结果，对索氏提取法提取苜蓿总黄酮各单因素的最佳条件进行验证实验．在物料比为1∶30，乙醇体积浓度为70%，提取温度为90 ℃，提取时间为3 h条件下，提取的苜蓿总黄酮提取率为9.48 mg/g，此条件下提取的苜蓿总黄酮超过本实验所有各单因素提取条件下的黄酮提取率．

3　讨论

各种材料进行黄酮类物质提取的研究中发现，大多数均采用乙醇作为提取溶剂，且乙醇的体积浓度大都在70%左右．在黄酮提取过程中乙醇的体积浓度主要受样品所含色素的有无及多少影响，色素含量少的样品，所用的乙醇体积浓度相对就高，反之，提取黄酮所需的乙醇体积浓度相对就低[8]．本实验筛选的乙醇体积浓度为70%时，能有效增加紫花苜蓿总黄酮的最大提取率，这与文献[7]采用3种不同的提取方法提取紫花苜蓿总黄酮，其回流浸提法的最优工艺参数为乙醇体积浓度70%的结果一致．

在一定范围内，液料比增加有利于系统浓度增加，进而增加有效成分与溶剂的接触机会，有利于黄酮类化合物的溶出[9]．文献[7]采用3种不同的提取方法提取紫花苜蓿总黄酮，其回流浸提法的最优工艺参数为料液比1∶20，与本实验筛选紫花苜蓿黄酮最佳物料比为1∶30的结果略有差异．

随着提取时间的增加，索氏提取器中回流次数增加，进而提高苜蓿总黄酮的提取率．索氏提取法利用溶剂回流和虹吸原理，让乙醇溶剂连续不断萃取固体物质，既节约溶剂同时也提高了萃取效率[10]．本实验采用索氏提取法，浸提温度90℃，浸提时间3 h所得总黄酮量均为5~9 mg/g，与文献[7]采用回流浸提方法提取紫花苜蓿总黄酮，提取时间4 h的结果略有差异．

4　结论

利用索式提取法对苜蓿黄酮提取率的物料比、乙醇体积浓度、浸提温度和浸提时间4个单因素的不同水平进行比较，在物料比为1∶30（g/mL），乙醇体积浓度为70%，提取时间为3 h，提取温度为90℃，最佳的苜蓿总黄酮提取率可达9.48 mg/g．

[1] 王成章，文开新，史莹华，等．紫花苜蓿黄酮的提取与纯化工艺初探[J]．草地学报，2013，21（2）：365-371

[2] 李小云，刘庆，田光辉．苜蓿中生物活性成分研究进展[J]．饮料工业，2012，15（12）：8-10

[3] 文开新，王成章，严学兵，等．黄酮类化合物生物学活性研究进展[J]．草业科学，2010，27（6）：115-122

[4] 赵娅敏，马好文，孟淑娟．紫花苜蓿中黄酮类化学成分及其生物活性研究进展[J]．中草药，2013，44（22）：3245-3252

[5] 陈秋荣．黄酮类化合物药理作用的分析[J]．中国实用医药，2012，7（21）：254-255

[6] 关雅琼，张曜武，杨浩．索氏提取器的起源与发展[J]．天津化工，2011，25（3）：17-20

[7] 荆常亮．紫花苜蓿总黄酮的提取、纯化及其抗氧化活性研究[D]．北京：中国农业科学院，2016

[8] 文开新．紫花苜蓿黄酮的提取与纯化研究[D]．郑州：河南农业大学，2011

[9] 闫琳娜．松针落叶总黄酮的提取、纯化及抗氧化性能分析[D]．长春：吉林大学，2009

[10] 傅春燕，罗聪，龙佳欣，等．龙牙百合总黄酮的索氏提取工艺正交优化及抗氧化性研究[J]．邵阳学院学报：自然科学版，2019，16（5）：64-72

Effects of different single factors on the extraction rate of total flavonoids fromL. cv. longmu No.801

LI Chenyang，HUANG Mingqi，LI Chuanzheng，LIU Dan，LAN Wenli，YANG Chenchen，LI Bo

（1. School of Life Sciences and Agriculture Forestry，2. Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Resistance Gene Engineering and Protection of Biodiversity in Cold Areas，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China）

UsingL. cv. longmu No.801 powder as material，the extraction of total flavonoids from alfalfa was studied．Compared the effects of four single factors on the extraction rate of total flavonoids in alfalfa．In order to determine the maximum extraction rate of Alfalfa flavonoids under various factors．The results showed that under the conditions of different solid-liquid ratio，ethanol concentration，extraction time and extraction temperature，the material ratio was 1∶30（g/mL），ethanol volume fraction was 70%，extraction time was 3 h，extraction temperature was 90 ℃，and total flavonoids extraction rate of alfalfa was 9.48 mg/g．

L. cv. longmu No.801；total flavones；extraction rate；single factor

Q94

A

10.3969/j.issn.1007-9831.2020.03.016

1007-9831（2020）03-0083-04

2019-11-02

黑龙江省省属高等学校基本科研业务费科研项目（135209267，YSTSXK201886）；齐齐哈尔大学2019年研究生创新项目（YJSCX2019043）；齐齐哈尔大学2019年大学生创新创业训练计划项目（201910232343）；齐齐哈尔市科技计划项目（NYGG-201916）

李晨阳（1995-），男，黑龙江齐齐哈尔人，在读硕士研究生，从事植物代谢产物提取研究．E-mail：501257387@qq.com

李波（1962-），女，辽宁鞍山人，教授，从事细胞生物学研究．E-mail：libo1962@163.com