紫外分光光度法测定尿液中枸橼酸的浓度

苏 琼 文 芳 熊桂斌 熊 欣 黄 露

(华中科技大学同济医学院附属梨园医院药剂科 武汉 430077)

柠檬酸是一种重要的有机酸，又名枸橼酸，无色晶体，常含一分子结晶水，无臭，有很强的酸味，易溶于水。柠檬酸是生理学中将脂肪、蛋白质和糖转化为二氧化碳的过程中的重要化合物。这些化学反应是几乎所有代谢的核心反应，并且为高等生物提供能量。柠檬酸是有机酸中第一大酸，由于物理性能、化学性能和衍生物的性能，是广泛应用于食品、医药、日化等行业最重要的有机酸[1～2]。

柠檬酸在柠檬酸裂解酶的作用下,生成α-酮酸(草酰乙酸),在弱酸条件下,α-酮酸与苯肼生成相应的α-酮酸苯腙,α-酮酸苯腙在330nm处有强的吸收峰,吸光度的变化程度可反映出柠檬酸含量[3～4]。通过柠檬酸裂解酶-苯肼显色的方法，建立了尿液中枸橼酸的测定方法。

1 仪器与试剂

仪器：UV-2450紫外分光光度仪(日本SHIMADZU公司)，PHS-3B精密pH计(上海精科雷磁)。

试剂：柠檬酸对照品(优级纯，纯度：99.8%, 国药集团化学试剂有限公司)；柠檬酸裂解酶(Citrate Lyase from Enterobacter aerogene，美国SIGMA公司)；叠氮钠(分析纯，武汉凯博实验仪器有限公司)，硫酸锌(分析纯,天津市博迪化工有限公司)，苯肼(分析纯，上海三爱思试剂有限公司)，Bis-Tris缓冲液(Amresco公司，纯度>98%)；试验用水为双蒸水(自制)。

2 方法

2.1 标准储备液和内标液的配制

苯肼液(246mmol/L)：使用前取50μl苯肼母液置于离心管内，加2.0ml蒸馏水混匀配制而成。每次使用前新鲜配制。

柠檬酸裂解酶溶液(13.3ku/L)：取活力为0.3u/mg的柠檬酸裂解酶44.44mg，溶于1ml蒸馏水中，于冰箱(0～4℃)保存备用。未使用完的裂解酶于-20℃冰箱保存保持活力。

Bis-Tris(50mmol/L)缓冲液：含0.1mmol/L的硫酸锌和0.2mmol/L叠氮钠,用12mol/L盐酸调节pH至6.5，于冰箱(0～4℃)保存备用。

柠檬酸母液(40 mmol/L)的配制： 精密称取柠檬酸标准品0.4202g，定容至50ml，配制成浓度为40 mmol/L的标准液，于冰箱(0～4℃)保存备用。

2.2 样品处理

20μl苯肼液(246mmol/L)置于EP管内，再加入20μl经0.22μm滤膜滤过的尿液或标准液或蒸馏水，涡旋混匀，平行配制两份，静置15min，加入1.0mlBis-Tris缓冲液，涡旋混匀，排气泡，一份在330nm处测定吸光度Awater，另一份加入20ul柠檬酸裂解酶溶液(13.3ku/L)，静置30min，测定吸光度Asample。ΔA=Asample-Awater，尿液中枸橼酸浓度按以下公式计算：Csample=(ΔAsample-ΔAwater)/(ΔAstd-ΔAwater)* Cstd。

3 方法学论证

3.1 标准曲线制备

精密称取柠檬酸标准品0.4202g，定容至50ml，配制成浓度为40 mmol/L的标准液，依次稀释成浓度为20，10，6，4，2，1 mmol/L的标液，取各浓度标液适量，空白尿液定容，配制成使加入浓度分别为4，2，1，0.6，0.4，0.2，0.1 mmol/L的尿样标准液，按样品处理方法进行测定，以所得吸光度的差值 (△A尿标-△A尿空)对浓度(C, mmol/L)进行线性回归(权重为1)，得枸橼酸尿药标准曲线方程为Y=0.2154X+0.0066，相关系数R2为0.9953，制备方法学标准曲线。

3.2 最低检测限(0.1mmol/L)精密度检测

取1 mmol/L浓度标液，空白尿液定容，配制成使加入浓度为0.1mmol/L尿样标液，按样品处理方法进行测定，平行处理5份，测定其吸光度，计算枸橼酸根离子浓度，测定结果批内标准差(RSD)为8.42%。

3.3 精密度试验

取2，6，20 mmol/L浓度标液，空白尿液定容，配制成使加入枸橼酸浓度为0.2，0.6，2mmol/L的尿样标液，每个浓度按样品处理方法平行处理5份，测定吸光度，连续测定3d，以此计算日内和日间变异，结果枸橼酸离子低，中，高浓度日内相对标准差(RSD)为4.04%、5.89%、4.93%，日间相对标准差(RSD)为6.44%、5.33%、3.46%(表1)。

表1 酶裂解-苯肼显色法测定尿中枸橼酸日内日间精密度(n=5)

3.4 相对回收率试验

取2，6，20 mmol/L浓度标液，空白尿液定容，配制成使加入枸橼酸浓度为0.2，0.6，2mmol/L的尿样标液，每个浓度按样品处理方法平行处理5份，测定吸光度，计算其枸橼酸根离子浓度，与理论的枸橼酸离子浓度相比，计算相对回收率。枸橼酸离子低、中、高3种浓度的平均相对回收率分别为103.40%、103.44%、98.78%。

3.5 稳定性试验

3.5.1放置稳定性

取0.2，0.6，2mmol/L低，中，高3个浓度尿样标液，分别于室温(25℃)下放置0h，2h，4h后，按尿液样品处理方法进行测定吸光度，计算其枸橼酸离子浓度，考察尿液样品在室温下不同时间条件下的稳定性，各浓度稳定性考察的RSD均小于7.0%(表2)。

3.5.2冻融稳定性

将0.2，0.6，2mmol/L低，中，高3个浓度尿样标液放入-70℃冰冻后取出解冻，分别于冻融前，冻融1次，冻融2次按尿液样品处理方法进行测定吸光度，计算其枸橼酸离子浓度，考察尿液样品反复冻融2次的稳定性，各浓度稳定性考察的RSD均小于7.0%(表2)。

3.5.3长期稳定性

取0.2，0.6，2mmol/L低，中，高3个浓度尿样标液，于-70℃冰箱保存，分别于配制当天、1周、2周和4周后取出，按尿液样品处理方法进行测定吸光度，计算其枸橼酸离子浓度，以考察尿液样品长期冷冻稳定性，各浓度稳定性考察的RSD均小于6.0%(表2)。

结果表明：低、中、高3个浓度的尿样在室温下放置4h内、冻融2次、-70℃条件下贮存4周内考察枸橼酸离子RSD均<7%，表明尿样在室温下4h内测定稳定，冻融3次测定稳定和-70℃条件下贮存4周内测定稳定。

表2 枸橼酸稳定性

4 方法学试验小结

通过柠檬酸裂解酶-苯肼显色的方法，建立了尿液中枸橼酸的测定方法，方法学试验结果表明本检测方法线性关系良好；精密度及准确度试验均符合要求，尿中枸橼酸低、中、高3种浓度的批间和批内变异均小于7.0%；稳定性试验表明枸橼酸在尿液中稳定性良好。方法学试验表明，本试验建立的柠檬酸裂解酶-苯肼显色测定法检测尿液中枸橼酸含量符合生物样品检测要求。与其他分析方法比较[3～9]，该方法回收率高，方法稳定经济，操作简便。本法可适用于枸橼酸大样本尿药浓度测定。