地中海贫血基因检测试剂盒抽验质量分析

张文新 于婷 孙楠 高飞 黄杰 曲守方

地中海贫血（简称地贫）是最常见的一种常染色体单基因遗传病，它是由于人体珠蛋白基因突变或缺失，导致珠蛋白肽链生成障碍而引起一种或几种珠蛋白肽链生物合成不足或完全缺乏，从而引发的一种遗传性溶血性贫血[1]。根据缺陷的珠蛋白类型，地贫可分为α、β、δ、γ 等几种类型，其中α-地贫和β-地贫是最常见的地贫类型。α-地贫（α-thalassemia）是一种由于α 珠蛋白链的合成减少或者缺失所导致的常染色体隐性遗传疾病。大多数的α-地贫是由于α 珠蛋白基因的缺失所致，少数由基因点突变造成，常见类型有SEA、α3.7、α4.2、Constant Spring（Hb CS）和Hb Quong Sze（Hb QS）等[2-3]。β-地贫（β- thalassaemias）是一种由于β 珠蛋白合成异常所导致的常染色体隐性遗传性疾病。β-地贫最常见的突变类型是β-珠蛋白基因点突变，少数为基因缺失，常见类型为CD41-42、IVS-Ⅱ-654、CD17、CD71-72等[4-5]。在我国常见于广东、广西、福建、海南、贵州、云南、四川、香港、台湾等地区，其中两广地区（广东和广西）乃地贫高发区。国家药品监督管理局批准的地中海贫血基因检测试剂盒，包括PCR-反向点杂交法[6]、荧光PCR 熔解曲线法[7]、PCR-导流杂交法[8]、裂口PCR 法（Gap-PCR）[9]、PCR-流式荧光杂交法[10]、PCR-荧光探针法和微阵列芯片法[11]等。地中海贫血基因检测试剂盒属于三类体外诊断试剂，漏检、假阳性、交叉反应、检测限不合理、适用样本类型不明确及缺少内控为该类试剂的最大的风险点。因此按照国家医疗器械抽验项目计划，对抽样的6家企业18 批次地中海贫血基因检测试剂盒进行监督检测和质量情况评估。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 抽样试剂盒及国家参考品

各省（区、市）食品药品监管部门结合体外诊断试剂国家监督抽验工作统筹安排，在规定期限内完成抽样、样品寄送和信息录入等工作。本次抽验共收到18个批次地中海贫血基因检测试剂盒，在生产环节（含进口总代理单位）抽到样品14批次，在使用环节抽到样品4 批次，涉及6家生产企业。地中海贫血核酸检测国家参考品（批次：360014-201701），由中国食品药品检定研究院提供。抽验产品的相关信息，见表1。

表1 抽样试剂盒Table1 Sampling kits

1.1.2 仪器

医用核酸分子杂交仪（厂家及型号：广州凯普，HB-2012A）、恒温杂交仪（厂家及型号：深圳亚能，YN-H16）、全自动医用PCR 分析系统（厂家及型号：上海宏石，SLAN-96S）、实时荧光定量PCR扩增仪（厂家及型号：美国Bio-Rad，CFX96）、液相芯片悬浮检测仪（厂家及型号：美国Luminex，MAGPIX）、凝胶成像系统（厂家及型号：美国Bio-Rad，Gel Doc XR+）。

1.2 方法

1.2.1 法定检验

按照企业注册产品标准/产品技术要求检验采用各企业提供参考品，分别检测对应抽检的检测试剂盒，检验项目包括准确性（阳性参考品符合率）、特异性（阴性参考品符合率）、检测限和重复性。按照各企业试剂盒说明书的操作步骤进行检测，最后对实验结果进行判定。为了验证抽验试剂盒的有效性，要求从生产环节和使用环节抽取相同批号的试剂进行测定。

1.2.2 探索性研究

YY/T 1527-2017《α/β-地中海贫血基因分型检测试剂盒》行业标准于2018年4月1日正式实施。地中海贫血核酸检测国家参考品（批次：360014-201701），包括32 份样本，均为基因组DNA，由临床样本建立的永生化细胞系提取获得，其中有3 份正常样本，其余29 份全部为地中海贫血基因突变的样本，涉及到9种α-地中海贫血基因突变类型和20种β-地中海贫血基因突变类型。依据行业标准，采用国家参考品，针对准确性、特异性、检测限3个项目开展探索性研究。

2 结果

2.1 法定检验结果

本次抽检共抽到18 批次的地中海贫血基因检测试剂盒，使用企业参考品，按照各自的企业注册产品标准/产品技术要求进行检测，合格产品数量为18 批次，占比为100%；不合格产品数量为0 批次。

以缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒（Gap-PCR法）为例，结果表明P1、PL1和R1 均为αα/-α3.7型别，P2和PL2 均为αα/-α4.2型别，P3和PL3 均为αα/--THAI型别，P4 、PL4和R2 均为-α4.2/--SEA型别，N1- N4 均为αα/αα型别；均符合相应的基因型别，见图1。

2.2 探索性研究结果

图1 企业参考品实验结果Figure1 The results of the en terprise refererce

18个批次的试剂盒均符合行业标准中准确性和特异性规定；但是有1个批次产品的检测限设置为20 ng/μL（说明书规定的样本上样量为3 μL 或6 μL），不符合行业标准中“检测限：不高于25 ng或4 000 拷贝”，不适用于探索性研究的实验设计，而其它17个批次的试剂盒均符合行业标准中检测限规定。以缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒（Gap-PCR法）为例，结果表明使用试剂盒检测范围内的国家阳性参考品进行检测，同时将这些参考品DNA 稀释至企业声称的2 ng/μL 检测限浓度进行检测，也都检出相应的基因型别，符合国家参考品的要求，即G5、G6、G30 均为αα/--SEA，G7为-α3.7/--SEA，G8为αα/-α3.7，G19为αα/-α4.2，G29为-α4.2/-α4.2，G32为αα/--THAI，见图2。另外对试剂盒检测范围外的国家阳性参考品和国家阴性参考品进行检测，均为αα/αα，没有交叉反应，符合国家参考品特异性要求，见图3和图4。

图2 国家参考品准确性和检测限实验结果Figure2 The results of the national reference for accuracy and detection limit

3 讨论

图3 国家参考品特异性实验结果Figure3 The results of the national reference for specificity

图4 国家参考品特异性实验结果Figure4 The results of the national reference for specificity

本次监督抽验工作是根据地中海贫血基因检测试剂盒的抽验方案，按照企业的注册产品标准或者技术要求，使用企业参考品或国家参考品进行检验，并出具检测报告。但是由于缺乏统一的评判标准，并不能对抽验的试剂盒质量做出客观的评价。目前国内现行有效的行业标准是YY/T 1527-2017《α/β-地中海贫血基因分型检测试剂盒》，该标准于2017年3月28日发布，于2018年4月1日正式实施，属于推荐性行业标准。中国食品药品检定研究院在2017年发布了地中海贫血核酸检测国家参考品。在该标准实施之前申报的试剂盒，均按照各企业制定的注册产品标准或者技术要求为依据进行检验，因此检测指标差异较大，试剂盒的质量参差不齐。而且注册申报的企业均采用自制参考品进行检测，其真实有效性无法保障。所以在监督抽验的探索性研究中，同时按照行业标准的要求和采用国家参考品检验，作为统一的尺度，用于评价不同试剂盒的质量[12]。

通过监督抽验工作，发现部分企业的产品标准或产品技术要求中的技术指标未按照行业标准的要求进行设置，有缺项或者内容不全的情况，例如未设置检测限项目，特异性项目中未设置对试剂盒检测范围外相应型别样本的检测；也发现部分企业的产品标准或产品技术要求中的技术指标低于行业标准的要求，例如重复性项目中重复检测的次数少于行业标准要求的次数，检测限项目检测的样本量高于行业标准要求的25 ng 或4 000拷贝。因为行业标准是最低的要求，建议企业应加强与实施的行业标准的一致性，而且应不低于行业标准的要求[13]；同时建议标准管理部门应加强对实施的行业标准的宣贯工作。

另外发现部分企业的自制参考品全部为质粒或部分为质粒，并未采用临床样本或临床样本提取的基因组DNA，因此不能反映临床真实样本的结果，也无法正确评估试剂盒的临床适用性。在检测地中海贫血检测试剂盒（PCR-导流杂交法）时，发现企业在技术要求和说明书的结果判定中均没有给出质粒参考品的结果示意图，导致对于质粒来源的企业阳性参考品无法进行判读，需要企业另外提供补充资料才能进行结果判读。抽验中还发现企业提供的说明书存在着其它很多问题：①首先企业说明书中没有提供试剂盒检测范围内的所有类型的结果示意图，对纯合突变或复合突变的部分国家参考品和企业参考品无法进行判读；②某些产品在后期产品注册审批的过程中，有些突变位点并未获得批准，这些突变位点并不在试剂盒说明书预期用途的检测范围内，但试剂盒本身具备检测相应突变的能力。这些突变的参考品均需要企业另外提供补充资料才能进行判读，使检测人员在监督抽验和注册检测中缺乏可操作性。

本次监督抽验涉及的抽样企业数量不多，涉及6家生产企业（覆盖率为60%）的14个试剂盒（覆盖率为48%），建议今后应加大抽验力度和抽验范围，完善和优化抽样模式，使抽验结果可以反映该类产品的真实质量情况。建议将试剂盒的抽验结果作为有效的参考数据，将监督抽验作为一项延续性的工作，在不同年度通过连续跟踪的方式动态评价试剂盒的质量变化，督促企业不断改进产品质量。