精胺对雌鹅卵巢生殖激素受体基因表达的影响

2020-05-22易治鑫李林祥姜冬梅

中国畜牧杂志 2020年5期

易治鑫，李林祥，徐进，李苗，姜冬梅

（1.四川农业大学动物科技学院，四川成都 611130；2.巴中市农林科学研究院，四川巴中 636000）

多胺（腐胺、亚精胺和精胺）在蛋白质生物合成、细胞增殖、分化和凋亡过程均具有重要调控作用[1-3]，多胺还能作为抗癌和抑癌药物的靶点[4-6]。研究发现，生殖激素对多胺代谢酶表达及其活性具有重要调控作用[7-9]，而多胺与激素受体之间也存在着某种复杂联系。Kang等[1,10]研究发现，干扰OAZ1会抑制鹅颗粒细胞促黄体生成素受体（Luteinizing Hormone Receptor，LHR）基因表达，而过表达OAZ1则会促进促卵泡激素受体基因（Follicle Stimulating Hormone Receptor，FSHR）和LHR表达。龙诗韵等[11]研究发现，0.15 mg/g 亚精胺能促进小鼠卵巢FSHR表达，下调LHR表达。月经周期的女性血浆雌二醇（E2）水平首次增加时伴随精胺含量最高峰，而E2与其受体的识别受到多胺调控[2,12]。高浓度亚精胺能介导小鼠卵巢雌激素受体（Estradiol Receptor,ER）基因的表达调控卵巢功能[11]。干扰OAZ1后颗粒细胞ER1表达下调，而过表达OAZ1后ER1表达上调[1,10]，提示多胺或多胺代谢基因能调控激素受体基因的表达。综上所诉，多胺或多胺代谢基因能介导生殖激素受体基因表达进而参与调控动物繁殖。然而，目前并不清楚外源性多胺是否会通过介导雌性动物生殖激素受体表达来参与调控动物性腺发育，同时尚未见有关多胺对早期性腺发育过程中性腺激素受体基因影响的报道。而近年来有研究表明精胺在雌性动物繁殖过程中具有重要调控作用[13-14]。因此，本研究用精胺灌胃雏鹅，探讨精胺对发育早期雌鹅卵巢组织FSHR、LHR、ER1和ER2表达的影响，以期为多胺调控家禽繁殖功能的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物与样品采集选择同批孵化、体况一致的28 日龄四川白鹅母鹅12 只。随机分为对照组（灌胃禽用生理盐水）和试验组（按5 mg/kg 体重的灌胃剂量灌胃精胺，每只鹅每次灌胃量为300 μL，精胺用超纯水溶解配制）。自由采食和饮水，每天于08:00 和20:00分别灌胃，连续灌胃2 周，分别于第8 天和第14 天进行称重。灌胃结束后，采集翅静脉血液5 mL 后颈部放血致死，迅速采集卵巢组织并称重。血液样品静置2 h 后，3 000 r/min 离心10 min，收集血清。平均日增重=（结测体重－始测体重）/ 测定天数，卵巢指数（g/kg）=卵巢鲜重/活体重。

1.2 组织总RNA 提取与cDNA 模板制备全部卵巢组织样品总RNA 参照Trizol 试剂（TaKaRa，大连）操作说明书提取，分别取5 μL 总RNA 于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA 质量。组织样品cDNA 反转录参照M-MLV 试剂盒（TaKaRa，大连）操作说明进行，并置于-20℃冰箱中保存备用。

1.3 实时荧光定量PCR 实时荧光定量反应体系为50 μL：iQTM SYBR®Green Supremix（Bio-Rad，USA）25.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，cDNA 模板2.0 μL，RNase Free H2O 19.0 μL。反应条件：95℃预变性3 min；95℃变性10 s，依据表1 中引物退火温度退火30 s，72℃延伸30 s（采集荧光），45 个循环；95℃ 10 s，60℃ 1 min，绘制熔解曲线。以GADPH作为内参基因，按照上述实时荧光定量PCR 反应体系和反应参数设置，定量检测四川白鹅卵巢组织样品中FSHR、LHR、ER1和ER2基因相对表达量，每个样品设3 个重复。实时荧光定量PCR 引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR 引物序列

1.4 统计分析根据荧光定量PCR 检测的目的基因Ct值，利用Excel 统计分析软件进行数据整理和统计分析。采用2-ΔΔCt法计算得出卵巢组织中FHSR、LHR、ER1和ER2基因的相对表达量。应用t 检验进行显著性分析，显著水准为α=0.05，结果表示为平均值±标准误。

2 结果与分析

2.1 精胺对鹅平均日增重和卵巢指数的影响如图1 所示，给雏鹅灌胃5 mg/kg 精胺2 周后，灌胃精胺组雏鹅平均日增重与对照组相比无显著差异。如图2 所示，给雏鹅灌胃5 mg/kg 精胺2 周后，灌胃精胺组卵巢重和卵巢指数与对照组相比均无显著差异。

2.2 精胺对鹅卵巢FSHR、LHR、ER1和ER2基因表达的影响如图3 所示，给雏鹅灌胃5 mg/kg 精胺2 周后，精胺处理组雏鹅卵巢组织中LHR和ER2表达量分别是对照组的4.78 倍和1.65 倍（P＜0.05）；而雏鹅卵巢组织中FSHR和ER1表达量与对照组相比无显著差异。

图1 精胺对鹅平均日增重的影响

图2 精胺对鹅卵巢重（A）和卵巢指数(B)的影响

图3 精胺对鹅卵巢FSHR、LHR、ER1 和ER2 基因表达量

3 讨论

生殖激素促进性腺发育和调控繁殖的功能需要通过受体识别和结合才能实现，而卵巢生殖激素受体的表达变化则会影响生殖激素的作用效应。与FSH 结合并产生效应的FSHR 主要分布于卵巢组织中，与卵母细胞的发育和成熟有关[15]；有研究认为，卵巢和卵泡中FSHR基因的表达量可能与家禽的性早熟有关[16]，提示FSHR基因能参与调控家禽性腺早期发育。本实验中，雏鹅灌胃2 周精胺后，鹅卵巢FSHR基因表达与对照组无显著差异，与上述研究结果不一致，推测在体成熟前雏鹅性腺发育相较迟缓，卵巢维持FSHR水平可能与机体为避免性早熟有关，这一推测还有待进一步研究证实。

Thyssen 等[17]研究发现外源性多胺能抑制促黄体生成素（LH）的分泌。而二氟甲基鸟氨酸（ODC 不可逆抑制剂）处理排卵前大鼠后，血浆中LH 含量降低，表明多胺能介导LH 水平参与调控繁殖[18]。据报道，在卵泡发育早期就有LHR基因开始表达，且与卵巢mRNA 水平有关[19-20]。在鹅卵巢发育早期，精胺能显著促进LHR基因表达，而LHR基因的表达是LH 发挥调控性腺发育和繁殖功能的保证，提示精胺能介导LHR基因的表达参与调控鹅早期卵巢发育[15,21]。

据报道，当多胺合成受到抑制时，E2与其受体之间的结合将会受到影响[12,22]，而精胺可能与E2和ER的结合识别有关[2]。ER 有ER1 和ER2 2 种亚型，敲除ER基因后的雌鼠缺乏生殖能力，窦卵泡生长受到抑制，并出现多囊性卵泡。因此，ER对卵巢卵泡发育具有重要作用[23]。有研究表明，在卵巢发育过程中ER2比ER1具有优势[23-25]。康波等[25]研究发现，在鹅卵巢发育早期均能检测到ER1和ER2，并认为在介导雌激素调控卵巢发育及卵巢功能中ER2 更具优势。经精胺灌胃后发现鹅卵巢ER2基因表达量显著，而ER1基因表达无显著差异，提示精胺可介导ER2基因表达参与调控雏鹅早期卵巢发育，进一步证实ER2 在早期卵巢发育中发挥主要作用。