肌红蛋白和线粒体互作的研究进展

罗 培，赵伟杰，王丽娜*，江青艳*

（1.广东省动物营养调控重点实验室，广东广州 510642；2.华南农业大学动物科学学院，广东广州 510642）

肌红蛋白（Myoglobin，Mb）是一种可移动的氧载体，主要存在于红肌中（I 型和Ⅱa 型骨骼肌），能够可逆性结合氧气，在低氧或剧烈运动条件下，将氧从肌膜运送到脊椎动物肌肉的线粒体中，通过呼吸链为细胞内各种物质代谢提供所需要的能量。据报道，肌红蛋白还能够结合多余的一氧化氮（NO），改善线粒体的有氧代谢[1]。也有研究发现，肌红蛋白部分定位于线粒体中，在肌肉收缩过程中通过与线粒体的相互作用满足肌肉代谢需求[2]。另一方面，线粒体及其呼吸对肌红蛋白的表达以及不同化合态的转化也有着重要影响。如在低氧运动条件下，脯胺酸羟化酶和低氧诱导因子（HIF1α）对肌红蛋白表达具有正向调控作用，且对肌纤维类型转化具有积极影响。同时，线粒体及其呼吸的中间产物对高铁肌红蛋白（metMb）的还原有促进作用，进而改善并维持肉色[3-4]。由此可见，肌肉中肌红蛋白与线粒体间的相互作用可能是改善肌肉氧化代谢、促进肌纤维类型转化的重要环节。虽然肌红蛋白与线粒体被发现的时间非常接近，但直至20 世纪末两者才被当作一个代谢组研究。自肌红蛋白被发现并被证实能够结合NO 后[5-8]，肌红蛋白就从传统观念上的氧储存器逐渐转变为生理催化剂并与线粒体联系起来，如肌红蛋白能调节线粒体氧代谢以及保护线粒体，且可能最终作用于肌纤维类型的转化。本文就近年来关于肌肉中肌红蛋白与线粒体间的相互作用的研究进展做一综述，以期为肉品质调控研究提供参考。

1 肌红蛋白和线粒体的结构与功能

自肌红蛋白的三级结构被阐明至今已接近60 年[9]。如图1 所示[10]，肌红蛋白由一条多肽链和血红素辅基构成，以铁卟啉为活性中心，呈紧密球形。肌红蛋白的主要功能最早被描述为储存氧气和氧气转运。氧气在血红素铁的第6 个配位位置可逆地结合肌红蛋白，引起毛细血管中肌红蛋白的构象改变，以氧合肌红蛋白的形式暂时储存在肌肉中，并能在机体缺氧或剧烈运动条件下，将其结合的氧释放并从肌膜扩散到线粒体中，充当线粒体电子传递链的最终电子受体，以氧化磷酸化为优先途径产生ATP 满足机体代谢需要[11]。

线粒体是存在于真核细胞中具有双层膜结构的细胞器，通过复合物和呼吸链在膜内外产生质子梯度，驱动三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP）的合成[12]，其结构如图2 所示[13]。线粒体的这种能量产生功能对于体内大多数细胞的存活是必需的，因此线粒体一度被认为是唯一负责能量产生的细胞器。但从20 世纪90 年代以后，线粒体的其他重要功能逐渐被发现，如调控细胞凋亡、参与免疫等。研究表明，线粒体已经与细胞信号转导、内环境稳态等息息相关，而线粒体自身稳态的维持以及下游活动的调控等还有待深入研究[14]。因此，线粒体与肌红蛋白的相互作用是全面理解两者生理作用的重要部分。

2 肌纤维类型与肉品质的关系

2.1 影响肉质的因素和肌纤维类型的特征 肉品质是畜牧业中最重要的经济性状之一，衡量肉品质的指标主要包括系水力[15]、肉色[16]、宰后24 h 的pH[17]、嫩度[18]和糖酵解电位[19]等。肉品质受遗传、营养、饲养环境和动物福利等多种因素的影响[20]，其中肌纤维类型是核心因素之一，在猪屠宰前后条件一致时，它决定了肌肉的组织化学特性进而影响多个肉品质指标，并决定最终口感[21]。根据肌球蛋白重链（Myosin Heavy Chain）的不同亚型，以及肌纤维的氧化和收缩特性，可将哺乳动物骨骼肌分为4 种类型，即慢速氧化型肌纤维MyHC I（I 型）、快速氧化型肌纤维MyHC IIa（IIa 型）、快速酵解型肌纤维MyHC IIb（IIb 型）和中间型MyHC IIx（IIx 型）[22]。其中I 型肌纤维含有丰富的氧化代谢酶、肌红蛋白、毛细血管以及线粒体等，具有较强的氧化能力，收缩慢且持久。而Ⅱ型肌纤维中毛细血管、线粒体以及氧化代谢酶含量少，含有大量的酵解相关酶，利用糖原产生能量，收缩快但不持久，易疲劳[23-24]。

2.2 肌纤维类型与肉品质的关系 不同肌纤维类型的占比及转化反映肌肉的形态结构和化学组成，从多个方面影响肉品质。动物放血后，肌红蛋白为影响肉色的主要因素，因此含有I 型肌纤维较多的肌肉具有更好的肉色或维持肉色的能力，含Ⅱ型肌纤维较多的肌肉则相反[25-27]。肉品嫩度本质上是反映切断一定厚度的肉块所需要的力量，很大程度取决于肌纤维类型、直径以及密度[28]。研究表明，Ⅰ型肌纤维的直径和密度均比Ⅱ型肌纤维低，肌肉中红肌纤维的比例与肉的嫩度和多汁性正相关[29-30]。动物屠宰后肌肉主要依靠糖酵解供能，导致肌肉的pH 在宰后1 h 内出现一定程度的下降，甚至影响蛋白质降解进而影响系水力[31-32]。研究表明，较高的Ⅱ型肌纤维比例会导致最终pH 和系水力降低[21]，影响肉的风味[33]。肌内脂肪是伴随着在肌束和肌纤维间结缔组织的发育而逐渐沉积在肌肉内的脂肪，肌内脂肪含量与肉的多汁性、风味和嫩度有密切关系。研究表明，肌内脂肪含量与Ⅰ型肌纤维比例呈正相关，且与其代谢特点有关[34-35]。

3 肌红蛋白与线粒体的互作及对有氧代谢的影响

3.1 肌红蛋白作为氧代谢的媒介促进线粒体呼吸和低氧适应 研究表明，一定范围内，肌红蛋白的浓度与低氧适应能力、运动耐力以及红肌比例呈正相关，且快速和慢速肌纤维的氧化纤维表型也是由肌红蛋白与编码线粒体的基因组的共表达定义的[36-38]。而线粒体的存在是氧合肌红蛋白脱氧的条件之一[39]，肌红蛋白与线粒体的互相作用是低氧适应的重要机制之一：在肌肉缺氧时，氧合肌红蛋白迅速脱氧，使毛细血管的氧分压增加，形成浓度梯度，同时自身的饱和度降低，靠近细胞膜，促进氧气扩散[40]，此时线粒体的密度和肌纤维横截面积也相应减少，减少了氧气需求以及肌纤维内氧气扩散的距离，促进了动物对低氧的适应[41]。虽然有研究否定了肌红蛋白在常氧条件下的促进氧扩散的作用[42-43]，但其在低氧下的作用已被认可[44]，且由于免疫组化等技术的发展，其作用得到了更深入的理解。

3.2 肌红蛋白部分定位于线粒体并提高能量转化效率 在21 世纪之前，肌红蛋白被认为以胞浆蛋白的形式存在于细胞中，直至Tatsuya 等[2]通过生化组织学和电镜分析首次证明了肌红蛋白少量定位于线粒体外膜上，且提出了肌红蛋白与线粒体呼吸链中的复合物Ⅳ存在相互作用的假说。这种定位形成了肌红蛋白-线粒体复合物，能够直接为线粒体输送氧气，而不是传统理念的由毛细血管跨膜运输，满足了肌浆网线粒体在肌肉收缩或急性缺氧条件下的代谢需要[45-46]，并能在收缩开始时立即刺激ATP 的合成。由于在机体氧化型肌纤维中肌红蛋白的数量及其与线粒体的共定位区域比糖酵解肌纤维更多，共定位的发现不仅证明了肌红蛋白的促氧扩散作用，同时也提示两者的相互作用可能与骨骼肌的肌纤维类型转化有重要影响。近年不少研究提出肌红蛋白定位于线粒体外膜的机制，如线粒体自身融合过程中肌红蛋白的融入以及线粒体外膜上脱辅基肌红蛋白摄入血红素等[47-48]，但目前依旧没有定论。

进一步研究表明[49]，肌红蛋白与线粒体呼吸链复合物IV 结合，且肌红蛋白的过表达虽然不影响线粒体的数量以及复合物I～III 中的关键呼吸酶的活性（泛醌还原酶NADH、泛醌还原酶FADH2 和泛醇细胞色素C还原酶），但能够通过增强细胞色素C 氧化酶的活性来显著增强复合物Ⅳ的活性，使线粒体的耗氧量增大，增强三羧酸循环从而使线粒体呼吸的底物减少，最终提高了二磷酸腺苷（Adenosine Diphosphate，ADP）对每个能量底物的ATP 转化效率并加强了肌细胞在增殖分化中的适应作用。

3.3 肌红蛋白通过调节NO 平衡改善线粒体有氧代谢肌红蛋白先后被发现有清除NO 和还原亚硝酸盐的作用[8,50]。NO 对于线粒体呼吸具有双重作用。在常氧条件下，多余的NO 能直接与酶的双核中心（CuB/ 血红素a3）结合，导致血红素a3 的可逆亚硝基化并竞争性抑制氧与酶的结合[51]，最终抑制线粒体呼吸；但在缺氧或缺血条件下，NO 能通过鸟苷酸环化酶信号转导途径影响血管张力以及心脏功能的维持等，缺乏NO 常常导致血压升高。Flogel[8]等将肌红蛋白描述为NO 的“清道夫”，即肌红蛋白在常氧条件下以氧合肌红蛋白（Oxymyoglobin,MbO2）的形式存在，氧合肌红蛋白能够结合NO 生成亚硝基肌红蛋白，而高铁肌红蛋白在高铁肌红蛋白还原酶的作用下还原成肌红蛋白，再与氧气结合形成氧合肌红蛋白，再次进行NO 降解循环。同时，线粒体摄取氧合肌红蛋白的氧分子生成的肌红蛋白也能结合NO，形成亚硝基肌红蛋白（Nitrosomyoglobin，MbNO），进而保护细胞色素C，并稳定和改善心脏和肌肉中的线粒体功能。

亚硝酸盐沿着生理氧梯度被还原成NO 和其他氮氧化物，且亚硝酸盐可以被视为在缺氧或代谢应激期间支持NO 信号传导的稳定储库，细胞色素C 也是催化这一过程的酶之一[52]。Matthias 等[53]首次证明了低氧或缺血条件下肌红蛋白在体内具有功能性亚硝酸还原活性，其在调节缺氧血管舒张中起关键作用，占血管舒张反应的50%，且其还原力是血红蛋白的60 倍。研究表明内源性亚硝酸盐的还原是平滑肌NO 水平上升的主要原因[54]，而在宰杀后加工的过程中，尤其是在使用硝酸盐和亚硝酸盐作为腌制剂时，外源性亚硝酸盐是主要原因[55]。在低氧条件下，肌红蛋白的浓度迅速上升，导致亚硝酸盐还原量显著增加，NO 水平显著上升，导致细胞色素C 的活性被竞争性抑制，机体氧耗下降，氧合肌红蛋白含量降低，同时氧合肌红蛋白对NO 的清除作用减弱，最后通过降低肌肉收缩性和氧消耗来下调心脏能量消耗[5,56]。另外，释放的NO 还可用于减少活性氧（ROS）的产生，减小氧化应激，保护线粒体的正常功能[57]。也有研究指出，肌红蛋白的这两种作用都受氧张力的调节，在氧供应增加时双加氧酶活性增加，导致NO 生物利用度降低，氧消耗也在响应中上调[58]。同样，氧气供应的减少增加了肌红蛋白的储备，导致更高的亚硝酸盐还原速率和NO依赖性呼吸抑制。通过这个复杂的系统，肌红蛋白、NO和氧调节彼此的浓度，以此维持最佳的线粒体功能[58]。

3.4 线粒体通过钙稳态调控低氧条件下肌红蛋白的表达由于线粒体能与骨骼肌中的肌浆网结合，线粒体通过钙单向转运蛋白（Mitochondrial Calcium Uniporter，MCU）影响游离钙离子的水平，并影响钙调磷酸酶的活性，而钙调磷酸酶信号转导途径对肌红蛋白的表达具有重要作用，因此线粒体与低氧下肌红蛋白表达水平的上升有关。研究表明，单独的低氧条件会优先刺激内质网钙库释放钙离子，但减少L 型管的钙内流，从而能抑制活化T 细胞核因子（Nuclear Factor of Activated T Cells，NFAT）进入细胞核[60]。但当缺氧与运动结合时，钙将从肌浆网中优先释放，在钙调神经磷酸酶的作用下促使磷酸化的NFAT 去磷酸化并移入到细胞核内，NFAT 与肌红蛋白基因启动子2 kb 上游片段结合，促进其转录。而钙调磷酸酶调节因子1（The Regulator of Calcineurin 1，RCAN1）作为钙调神经磷酸酶的内源性抑制因子，能抑制其活性从而抑制NFAT 的去磷酸化，最终导致肌红蛋白表达受阻[61-62]。低氧条件下，脯氨酸羟化酶（Prolyl Hydroxylase Domain，PHD）羟基化（Hypoxia-inducible facto 1α，HIF 1α）反应受阻，导致HIF1α在细胞内聚集并进入核诱导多种靶基因表达，启动低氧应答反应[63-64]。HIF1α的低氧反应涉及了很多生理过程，如血管生成以及糖酵解（转运酶1 和4）等，其中促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）的生成也能通过血红素辅基的增多间接影响肌红蛋白的合成[49,64]。同时，其他研究表明，低氧通过Wnt 通路[33,65]、磷酸腺苷（Adenosine Monophosphate，AMP）通路等[33]也可以影响肌红蛋白水平，且线粒体具有自由基清除能力，这也保护了肌红蛋白。然而，低氧诱导因子HIF1α对钙调磷酸酶信号转导通路的影响仍待继续研究。

3.5 线粒体及其中间产物促进高铁肌红蛋白的还原 在动物屠宰后，肌红蛋白的存在形式和含量是肉色的决定因素。已有研究表明，随牛肉储藏时间的延长，肉色将从暗红色氧化为鲜红色，最后发生褐变，3 种色泽分别对应肌红蛋白、氧合肌红蛋白和高铁肌红蛋白[66]。肉色作为肉品质的感官指标之一，尤其在冷鲜肉中，已经成为影响消费者购买的决定因素，而目前的研究主要集中于低氧条件下体内肌红蛋白转录水平的调控以及高铁肌红蛋白还原活性的调控，最终作用于肉色稳定性的提升。其中，线粒体与肌红蛋白间的互作逐渐受到关注。研究已经发现线粒体浓度及线粒体呼吸对高冷藏牛肉或羊肉中铁肌红蛋白的还原存在着积极的影响[67-68]，且肌红蛋白提取简单，具有较高的可行性和经济性，因此研究肌红蛋白和线粒体互作对肉品质的影响或有较好前景。

4 结论

畜禽的肉品质与骨骼肌肌纤维类型及机体能量代谢密切相关，不同的纤维类型在氧代谢和代谢底物的利用效率上有不同特点。肌红蛋白部分定位于线粒体，并通过调控线粒体的氧平衡和一氧化氮平衡等改变线粒体的有氧代谢和能量利用效率。而线粒体则在低氧下通过调节钙稳态来调控肌红蛋白的表达，有利于肌肉的氧供应和氧代谢，且线粒体能在肉类储存过程中对肌红蛋白的氧化还原产生影响。随着研究的继续深入，未来有望通过肌红蛋白和线粒体的相互作用改善肌肉有氧代谢和能量代谢，进而促进肌纤维类型的转换，最终改善畜禽肉品质。