成年人鼻中隔软骨的成分分析

徐海艇，胡科鹏，薛继鑫，史吏，宋永焕，李晓阳

（1.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院整形外科，浙江温州325027；2.温州医科大学仁济学院，浙江温州325035）

鼻整形通常需要结构材料来修复因外伤、先天性畸形或先前手术切除而造成的软骨缺损[1]，自体的、异体的、合成的植入物和移植物都有较广泛的应用。然而，异体材料具有免疫排斥、疾病传播和再吸收的风险，而合成材料与感染、挤压和异物反应的风险相关[2]。因此自体软骨往往是首选的材料，供区多来自鼻中隔软骨，耳甲腔和肋软骨区。在这些材料中，自体鼻中隔软骨因其良好的力学性能、容易获取、供体部位发病率低而成为鼻部重建的首选材料[3]。然而，自体鼻中隔软骨的应用受到多种限制，如可用组织数量有限、部分缺损重建几何结构不佳。这些限制促使研究人员探索寻找软骨自体移植物的替代重建材料。组织工程所需的自体鼻中隔软骨形状和数量可以通过扩增培养软骨细胞制作出来[4]，然后在三维培养系统中进行分化以产生功能软骨细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）[5]。成熟和塑形阶段可产生与预期的形状和结构特性相一致的新生软骨[6]。然而重建鼻中隔软骨，必须要明确鼻中隔软骨各部位的成分。本研究将鼻中隔软骨分为5个区域以更好地理解鼻中隔软骨成分与不同区域的关系。

1 材料和方法

1.1 材料 7具匿名新鲜冷冻尸体的鼻中隔软骨，2015年2月至2018年2月（解剖教研室提供）均无明显的鼻中隔软骨偏曲。本研究经本院伦理委员会批准。

1.2 方法 用鼻翼缘闭合切口或开放切口的方法，逐层暴露7位成年人尸体鼻部解剖层次，然后完整切取鼻中隔软骨，清除表面软组织，并将鼻中隔软骨分为5个区域，分别标记为a，b，c，d，e区（见图1）。

图1 鼻中隔软骨5个区域分布

1.3 生化检测 生物化学测定用的样品在磷酸盐缓冲的乙二胺四乙酸（0.5mg/mL）中用蛋白酶K（proteinaseK，PK）使其消化溶解一夜，温度为55℃。采用适用于人软骨的PicoGreenDNA含量测定法（美国Invitrogen公司）测定细胞数量。取每个样品消化液的一部分与PicoGreen试剂混合。在荧光分析仪上用480nm激发光波长和520nm发射波长测定荧光。在适当的缓冲溶液中，用人类DNA度量标准将荧光值转换为DNA量。再将DNA含量标准化，以确定细胞数（7.8pgDNA/软骨细胞）和每mg湿组织质量。

采用PK消化液和二甲基亚甲基蓝（dimethylmethyleneblue，DMMB）反应测定硫酸糖胺聚糖（sulfatedglycosaminoglycans，sGAG）的含量。每个样本取消化液的一部分与DMMB染料混合。用荧光分析测得525nm处的吸光率，并与用C型硫酸软骨素制成的标准品（美国Sigma公司）进行比较。人软骨中存在的sGAG主要是硫酸软骨素，透明质酸和角蛋白硫酸酯所占比例较小[7]。因此，使用硫酸软骨素作为标准来源进行比较是合理的。此外，用该方法测定sGAG与人软骨的固定电荷密度高度相关。sGAG含量用每mg湿组织质量（消化前）和DNA含量进行标化。

采用羟脯氨酸法测定PK消化液中总胶原蛋白的含量[7]。在通风柜中，加入与样品体积相等的12.1mol/L盐酸（美国Sigma公司），在110℃下孵育16～18h。样品从高温中取出，让其恢复到室温，短暂离心，在110℃（16～24h）条件下蒸发干燥。干燥后的样品溶解在枸橼酸盐缓冲液中。将部分重组样品和羟脯氨酸标准品与氯胺T试剂反应，然后再与对二氨基苯甲醛反应，用EMAX精密微孔板读数仪（美国Sunnyvale公司）在560nm处读取吸光率。以羟脯氨酸衡量标准为基础，将样品吸光率转换为羟脯氨酸含量。羟脯氨酸含量按每mg湿组织质量（消化前）和DNA含量进行标化。根据胶原蛋白与羟脯氨酸的质量比值（为7.1），将羟脯氨酸含量转化为胶原蛋白含量。

1.4 统计学处理方法 采用SPSS20.0软件进行统计分析。计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey-HSD法检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 每mg湿重细胞数和胶原蛋白量 湿软骨片段5个区域每mg湿重细胞数差异无统计学意义（P＞0.05），每mg湿重的胶原蛋白含量差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2 每mg湿重所含sGAG量 每mg湿重的sGAG含量各区域间差异有统计学意义（P ＜0.01）；与a区和c区比，b区和d区的sGAG含量显著增加（P＜0.05），可知sGAG在鼻中隔软骨并非均匀地分布于各个区域，见表1。

2.3 胶原蛋白与sGAG的比值 胶原蛋白与sGAG的比值在各区域间差异有统计学意义（P＜0.01）；与a区和c区比，b区、d区和e区胶原蛋白与sGAG的比值显著减小（P＜0.05），见表1。

表1 鼻中隔软骨成分5个区域的变化（每组n=7，

表1 鼻中隔软骨成分5个区域的变化（每组n=7，

与a区比：aP ＜0.05；与c区比：bP ＜0.05

区域 每mg湿重细胞数（×103） 每mg湿重所含胶原蛋白（μg） 每mg湿重所含sGAG（μg） 胶原蛋白与sGAG的比值总量 22.9±2.9 60.3±6.4 14.6±3.5 4.14±0.8 a 23.0±2.9 60.9±6.2 13.1±1.6 4.61±0.4 b 24.1±2.5 62.5±5.9 16.5±1.3ab 3.70±0.3ab c 21.7±3.1 59.0±7.2 12.7±0.9 4.65±0.4 d 22.5±3.1 61.4±7.1 16.3±1.1ab 3.81±0.8ab e 23.4±2.6 57.7±4.7 14.5±2.4 3.92±0.2ab F 0.715 0.654 9.336 6.609 P 0.588 0.629 ＜0.001 ＜0.001

3 讨论

成人软骨含有软骨细胞和大量的ECM，按重量计算胶原蛋白是最丰富的分子成分。已经证明ECM中的胶原纤维可以加强软骨组织的完整性、抗拉刚度、抗拉强度和抗胀性。蛋白聚糖是软骨的另一主要分子成分，主要以聚集蛋白聚糖的形式存在。高分子聚合蛋白由一个附着许多sGAG链的核心蛋白质组成[8]。虽然关节软骨的组成已被充分记录，但以前的研究没有量化人鼻中隔软骨主要成分（软骨细胞、胶原蛋白和硫酸化糖胺聚糖）的相对湿重。为了提供用于重建新的人鼻中隔软骨基线数据，本研究使用7个成人鼻中隔软骨标本建立这样的信息。

NEUMAN等[9]从鼻中隔软骨（刚好在上颌嵴之上）获取软骨，测定了人鼻中隔软骨的细胞结构和主要基质成分，其研究结果显示，每mg软骨湿重含24900个细胞（3700～51800），77.4μg胶原蛋白（458～128.6μg），28.7μgsGAG（13.6～44.6μg），胶原蛋白与sGAG的平均比值为3.03。这与本研究中所得的数值相当。许多组织的软骨成分因其特定位置而异，如关节软骨组成取决于关节的位置、关节的区域和关节表面的深度。已报道的人类关节软骨细胞数量比本研究中鼻中隔软骨的测量值低两倍左右[10]，而文献中测定的人股骨髁中的胶原蛋白和sGAG则比鼻中隔软骨ECM中的值高。虽然关节软骨和鼻中隔软骨都归为透明软骨，但它们有不同的胚胎起源和内在固有的功能，这可能解释了它们在组成上的一些差异[11]。本研究发现鼻中隔软骨主要成分中软骨细胞数和胶原蛋白含量在不同区域没有明显的变化。鼻中隔软骨sGAG含量在不同区域有明显的变化，胶原蛋白与sGAG的比值也有明显的差异。此外，sGAG沉积的局部形态与鼻整形或鼻重建术中着重保留的L型支柱形状相一致。

软骨细胞ECM中某些结构分子的相对量影响软骨的机械刚度、强度和稳定性。在人类关节软骨中，糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）分子赋予组织固定的负电荷，增加组织膨胀和抗压负荷的能力，而拉伸强度主要归因于胶原蛋白网络的作用[12]。软骨中的sGAG（GAG的一种）侧链负责其净负电荷，吸引正离子和水进入ECM。关节软骨中，胶原蛋白的含量是GAG含量的2～10倍，其含量取决于取样组织的区域和组织承受的机械载荷[13]。机械强度和硬度与胶原蛋白与GAG的比值增加密切相关。在本研究中，人鼻中隔软骨中胶原蛋白的平均含量约为sGAG含量的4.14倍，鼻中隔软骨b、d区域sGAG含量明显高于a、c区。基于上述对关节软骨的研究，预测代表鼻中隔软骨腹侧的b、d区域也将具有更大的抗压能力和韧性，这一特性与该区域的解剖基础有关，即位于鼻中隔软骨的基底部。

在鼻整形术和鼻部重建手术相关研究中，重点强调了鼻中隔软骨的背侧和尾侧的L型支柱是支撑和维持鼻部稳定的关键区域之一，还为鼻部提供结构稳定性的作用[14-15]。这一区域的畸形或缺陷可造成美学和功能问题，如马鞍鼻畸形、鼻尖位置不正、扭曲鼻；因此，本研究中报道的鼻中隔软骨a、c区胶原蛋白与sGAG比值较高支持了这一假设，即该区域鼻中隔软骨有更大的机械强度和硬度，科学地证实了L型支柱保留的价值。

组织工程重建的人鼻中隔软骨组织若要适应人类体内环境，必须持久适应体内环境的力学需求，在形态学、组织学、生化和生物力学特性上都要与原生组织相似。本研究提供了人类鼻中隔软骨组成成分的量化图，组织工程化鼻中隔软骨很有可能在未来头颈部重建外科学上发挥作用。

综上所述，深入了解人鼻中隔软骨的天然成分，将作为设计符合特定重建目标的工程新技术的基础。未来的实验工作将包括绘制整个人类鼻中隔软骨的力学特性。