复氧前给予不同浓度乳化异氟醚的大鼠缺氧/复氧心肌细胞损伤情况观察

王佳琪,徐鹏,陈伟,李晓娟,王海英,喻田

1 遵义医科大学附属医院，贵州遵义563000；2 湘潭市中心医院

随着缺血性心肌病发病率逐年提高，手术治疗缺血性心肌病也日渐普遍，但此过程不可避免的发生心肌缺血再灌注损伤(MIRI)。如何降低MIRI成为减轻心脏疾病术后并发症的重要策略。乳化异氟醚(EI)由液态异氟醚溶于30%脂肪乳(FAT)配制而成，兼有静脉麻醉药和挥发性麻醉药的优点。研究[1]显示，应用EI后处理可以减轻MIRI，推测EI发挥了抵抗氧化应激的功能[2]。NF-E2相关因子2/抗氧化反应原件通路(Nrf2-ARE通路)在抗氧化应激、降低MIRI过程中扮演着重要的角色[3]。本课题组前期使用EI处理离体鼠缺血再灌注心肌，证实了EI可通过激活Nrf2-ARE通路而达到减轻MIRI的目的。2013年9月～2017年6月，我们观察了不同浓度EI处理对大鼠缺氧/复氧心肌细胞的保护作用，并探讨其保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 心肌细胞分离及培养 雄性SD大鼠，体质量250～300g，16～20周龄，由陆军军医大学大坪医院动物中心提供，证书号：SCXK(渝)2012-0005。大鼠腹腔注射异戊巴比妥钠(40 mg/kg)、肝素(250 μg/kg)，待麻醉起效后开胸剪下心脏，立即放入0 ℃、750 μmol/L Ca2+液中挤压排尽心腔中的血液。将心脏主动脉根部固定于Langendorff离体心脏灌注装置上，先后灌注经氧合的750 μmol/L Ca2+液2 min、100 μmol/L 无Ca2+EGTA液4 min、0.1% Ⅱ型胶原酶15 min(流量设置为9 mL/min·g)，随后用无菌剪刀剪下心室，纵向将心室肌剪开放入盛有含1% BSA的Ⅱ型胶原酶液摇瓶，在37 ℃恒温水浴摇床中手动顺时针摇动摇瓶5 min，通过200目尼龙滤网收集到无菌管中待细胞沉淀，以上步骤重复4次。混合所有细胞并弃上清，加入酶洗脱液、M199培养基洗涤2次后，用台盼兰染色判定细胞存活率，大于90%则将细胞混合M199培养基以1×104～1×106个/cm2的密度平铺于预先用层黏连蛋白处理的六孔板中，4 h后吸走未贴壁细胞并重新加入新鲜M199培养基继续培养24 h，用于后续实验。

1.2 缺氧/复氧心肌细胞模型的制备及验证 采用混合气体培养法制备缺氧/复氧心肌细胞模型。将心肌细胞分为正常组(N组)、缺氧/复氧模型组(HR组)、脂肪乳组(FAT组)。N组在37 ℃、95% O2+5%CO2培养箱中持续培养105 min；HR组在37 ℃、95% N2+5%CO2培养箱中缺氧培养45 min，然后在37 ℃、95% O2+5%CO2培养箱中复氧培养60 min；FAT组在37 ℃、95% N2+5%CO2培养箱中缺氧培养45 min，加入脂肪乳处理5 min，然后在37 ℃、95%O2+5%CO2培养箱中复氧培养55 min。收集三组心肌细胞，1 200～2 000 r/min低速离心10 min使细胞成团，加入4 ℃、2.5%戊二醛固定液固定后，经乙醇梯度脱水、包埋聚合、超薄切片，在H7500透射电镜下观察两组心肌细胞超微结构。观察发现，HR组、FAT组心肌细胞线粒体排列紊乱，线粒体空泡化及囊泡化，外膜连续性丧失，少部分线粒体甚至破裂、溶解，心肌肌原纤维杂乱排列，肌浆网扩张，细胞核形态不一，核膜溶解消失；N组心肌细胞细胞器基本正常；表明缺氧/复氧心肌细胞模型建立成功，且脂肪乳的加入对缺氧/复氧心肌细胞模型的建立无影响。

1.3 心肌细胞分组及EI给予方法 随机将心肌细胞分为FAT组和不同浓度EI处理组(EI1组、EI2组、EI3组)。FAT组在37℃、95%N2+5%CO2培养箱中缺氧培养45 min，加入FAT处理5 min，然后在37 ℃、95%O2+5%CO2培养箱中复氧培养55 min；不同浓度EI处理组(EI1组、EI2组、EI3组)在37 ℃、95%N2+5%CO2培养箱中缺氧培养45 min，分别加入三种浓度EI(EI1组：0.84 mmol/L，EI2组：1.68 mmol/L，EI3组：2.52 mmol/L)处理5 min，然后在37 ℃、95%O2+5%CO2培养箱中复氧培养55 min。

1.4 各组细胞线粒体损伤评分(Flameng评分)及细胞内游离Ca2+荧光强度测定 ①收集各组心肌细胞，1 200～2 000 r/min低速离心10 min使细胞成团，加入4 ℃ 2.5%戊二醛固定液固定后，经乙醇梯度脱水、包埋聚合、超薄切片，在H7500透射电镜下观察，每个标本随机选择5个视野，每个视野内随机选择20个线粒体，通过线粒体Flameng评分标准对所选择的线粒体进行评分。0分：线粒体结构正常,充满颗粒；1分：线粒体结构基本正常，基质颗粒丢失；2分：线粒体肿胀,基质透明；3分：线粒体嵴断裂,伴基质透明和浓聚；4分：线粒体嵴分裂，线粒体内外膜完整性消失，呈空泡状。最后将100个线粒体所得的总分取平均值，即为该标本的Flameng评分。Flameng评分越高表示细胞损伤越严重。②收集各组心肌细胞，加入10 μmol/L Ca2+探针Fluo-3，放于37 ℃培养箱内培养1 h，在激光共聚焦显微镜下观察，通过Sp2软件分析心肌细胞内游离Ca2+荧光强度。心肌细胞内游离Ca2+荧光强度越高表示细胞损伤越严重。

1.5 各组细胞内Nrf2蛋白核转位荧光强度观察 收集各组心肌细胞，经0.5%TritonX-100处理，在1%BSA的PBS溶液中孵育、封闭、结合Nrf2单克隆抗体一抗(稀释度1∶1 000)、结合荧光标记的山羊抗兔IgG抗体(稀释度1∶1 000)，用DAPI染料标记细胞核5 min，在激光共聚焦显微镜下观察，通过Image Pro Plus系统分析细胞内Nrf2蛋白核转位荧光强度。

1.6 各组细胞中Nrf2、血红素加氧酶-1(HO-1)、超氧化物歧化酶1(SOD1)、醌氧化还原酶1(NQO1)mRNA检测 采用RT-PCR法。收集各组心肌细胞，TRIzol法提取总RNA，逆转录成cDNA，以cDNA为模板，进行PCR扩增。引物序列如下：Nrf2上游引物为5′-TTGGCAGAGACATTCCCATTTGTA-3′，下游引物为5′-ATCAGTCATGGCCGTCTCCAG-3′；HO-1上游引物为5′-AGGTGCACATCCGTGCAGAG-3′，下游引物为5′-TCCAGGGCCGTATAGATATGGTACA-3′；SOD1上游引物为5′-AATGTGTCCATTGAAGATCGTGTGA-3′，下游引物为5′-GCTTCCAGCATTTCCAGTCTTTGTA-3′；NQO1上游引物为5′-TGGAAGCTGCAGACCTGGTG-3′，下游引物为5′-TTGTCATACATGGTGGCATACGTG-3′；GAPDH上游引物为5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物为5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。PCR反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s、61.4 ℃退火20 s，循环40次。以2-ΔCt表示细胞中目的基因mRNA的相对表达量。

1.7 各组细胞Nrf2、HO-1、SOD1、NQO1蛋白检测 采用Western blotting法。收集各组心肌细胞，BCA法对蛋白定量，SDS-PAGE电泳仪行蛋白质电泳，电泳结束后按分子量切取凝胶，并进行转膜、封膜，分别封闭一抗(稀释度1∶500)4 ℃ 过夜，加入荧光二抗(稀释度1∶10 000)，采用Odyssey红外荧光成像系统避光封闭1 h，扫描PVDF膜，记录各条带的积分光密度值(IOD值)，计算目的蛋白的相对表达量。目的蛋白相对表达量=目的蛋白IOD值/内参蛋白IOD值×100%。

2 结果

2.1 各组细胞线粒体Flameng评分及细胞内游离Ca2+荧光强度比较 各组细胞线粒体Flameng评分及细胞内游离Ca2+荧光强度比较见表1。由表1可知，不同浓度EI处理组线粒体Flameng评分和细胞内游离Ca2+荧光强度均低于FAT组，且EI2组最低。

表1 各组细胞线粒体Flameng评分及细胞内游离Ca2+荧光强度比较

注：与EI1组相比，aP<0.05；与EI2组相比，bP<0.05；与EI3组相比，cP<0.05。

2.2 各组细胞内Nrf2蛋白核转位荧光强度比较 EI1组、EI2组、EI3组、FAT组细胞内Nrf2蛋白核转位荧光强度分别为152.71±13.36、181.95±10.59、156.39±11.20、135.25±19.73；其中，EI2组细胞内Nrf2核转位荧光强度与EI1组、EI3组、FAT组相比，P均<0.05；EI1组、EI3组细胞内Nrf2核转位荧光强度与FAT组相比，P均<0.05。

2.3 各组细胞中Nrf2、HO-1、SOD1、NQO1 mRNA和蛋白相对表达量比较 各组细胞Nrf2、HO-1、SOD1、NQO1 mRNA和蛋白比较见表2。由表2可知，不同浓度EI处理组Nrf2、HO-1、SOD1、NQO1 mRNA和蛋白相对表达量均高于FAT组，且EI2组最高。

3 讨论

Jenning[4]早在1960年便提出了MIRI。研究[5，6]显示，药物后处理是目前减轻MIRI最优的方式。EI是我国自主研发的新型麻醉药，它与传统的异氟醚相比具有可控性强、使用方便、不污染环境且效能高的优点，且已经证明其可安全用于动物实验[7]，起到脑保护[8]、肾脏保护[9]及心肌保护作用[10],其对于MIRI保护作用可能与激活Nrf2-ARE通路有关。本研究观察了EI对缺氧复氧心肌细胞保护作用的机制，并探究其最佳保护浓度。

表2 各组细胞Nrf2、HO-1、SOD1、NQO1 mRNA和蛋白相对表达量比较

注：与EI1组相比，aP<0.05；与EI2组相比，bP<0.05；与EI3组相比，cP<0.05。

细胞超微结构的改变是其损伤最直观的肉眼表现[11]，与N组相比，HR组心肌细胞在电镜下失去正常超微结构，损伤极为严重，且FAT组心肌细胞损伤与HR组相似，说明本实验大鼠缺氧/复氧心肌细胞损伤模型制备成功，且FAT对于缺氧/复氧心肌细胞损伤模型无影响。

线粒体是细胞有氧氧化能量产生的聚集地，对缺血、缺氧十分敏感，其结构的改变往往与细胞的生存状态密切相关[12]。当细胞缺氧时会发生代谢紊乱，乳酸和琥珀酸堆积，当其再次遇到氧气时，会产生活性氧，发生细胞核内Ca2+堆积进而导致细胞凋亡,故本实验以线粒体Flameng评分和细胞内游离Ca2+荧光强度来判断细胞损伤状况。线粒体Flameng评分和细胞内游离Ca2+荧光强度均显示，不同浓度EI处理组线粒体Flameng评分和细胞内游离Ca2+荧光强度均低于FAT组，说明EI对于缺氧/复氧细胞有保护作用，其中EI2组最低，说明此时EI的浓度对缺氧/复氧细胞的保护作用最佳。

当Nrf2蛋白受到亲电子物质作用时，会发生磷酸化进入细胞核识别ARE，启动下游靶基因如HO-1、SOD1、NQO1的表达，激发细胞对抗氧化应激的能力[13]。本实验细胞内Nrf2蛋白核转位荧光强度显示，不同浓度EI处理组细胞内Nrf2蛋白核转位荧光强度均高于FAT组，且EI2组最高，说明EI可以促进Nrf2蛋白进入细胞核，且EI2组的浓度对于促进Nrf2蛋白核转位最佳。同时，本研究结果显示，Nrf2及Nrf2/ARE通路的下游产物HO-1、SOD1、NQO1 mRNA和蛋白相对表达量在不同浓度EI处理组表达较FAT组升高，且EI2组最高，说明EI对缺氧/复氧心肌细胞的保护作用是通过激活Nrf2/ARE通路而实现，且EI2组的浓度(1.68 mmol/L)保护作用最佳。

综上所述，复氧前给予不同浓度EI处理对大鼠缺氧/复氧心肌细胞均可起到保护作用，1.68 mmol/L EI是减轻大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的最适浓度，EI可能是通过激活Nrf2/ARE通路发挥保护作用。