施用石灰对镉胁迫下三七皂苷产量及相关酶活性的影响

2020-05-20梅馨月祖艳群

生态与农村环境学报 2020年4期

李娜，梅馨月，李琦，祖艳群

(云南农业大学资源与环境学院，云南昆明 650201)

三七(Panax notoginseng)为五加科人参属多年生草本植物［1］。三七以根部作为药用部分，具有活血化瘀、消肿定痛的效果［2］，对心脑血管病也有疗效。目前，云南省三七种植面积和产量分别占全国三七种植面积和总产量的98% 以上［3］。三七的主要产地位于云南省文山市，文山矿产资源丰富，丰富的矿业活动导致部分三七种植区域重金属污染严重［4-5］。由于三七种植区域属于富铅锌矿地区，镉的土壤背景含量较高［6-10］，加上三七属于多年荫生植物，易富集重金属［11-13］，所以部分地区的三七镉含量较高，不仅严重制约着文山三七产业的发展，对中药材安全和国际贸易也产生严重威胁。施用石灰可以改良土壤，降低土壤的有效镉含量，缓解镉对植物的毒害作用［14］。在施加石灰时，施加量与土壤pH值之间有很大的关系。土壤pH值处于5.0～5.5之间、石灰施入量为3 000～6 000 kg·hm-2时植物的增产率最大，显著高于用量低于750 kg·hm-2的石灰处理［15］。

三七的主要药效成分为达玛烷型四环三萜皂苷类物质，其中Rg1、Rb1为人参皂苷，R1为三七皂苷，Rb1是人参二醇人参皂苷，Rg1是原人参三醇型人参皂苷，在合成过程中需要一些重要的酶催化作用才能进行。其中，达玛烯二醇合成酶(Dammarenediol-Ⅱsynthase，DS)催化 2，3-氧化鲨烯生成达玛烯二醇(Dammarenediol)，再通过细胞色素P450(cytochrome P450，CYPs)和糖基转移酶(glycosyltransferase，GT)的催化，生成多样的达玛烷四环三萜类皂苷。在此过程中，鲨烯合酶(squalene synthase，SS)、鲨烯环氧酶(SE)、达玛稀二醇合成酶(Dammarenediol-Ⅱsynthase，DS)、GT 和细胞色素P450是合成达玛烷四环三萜类皂苷的关键酶［16-19］。目前，多数研究集中在外源添加石灰可以有效缓解Cd对三七生长、生理、根部形态和根系分泌物的影响，Cd胁迫下三七的药效成分以及Cd污染下三七的健康风险上［20-22］，鲜见关于石灰缓解Cd对三七主要药效成分以及关键酶影响的研究。因此，笔者研究外源添加石灰缓解Cd对三七药效成分及合成中关键酶活性的影响，以期进一步揭示外源添加石灰对Cd胁迫下三七药效成分的影响机制。

1 材料与方法

1.1 试验设计及样品采集

田间试验于文山市丘北县滥泥寨村(24°11"05″N，104°03"45″E)进行。采取大田试验方法，供试品种为文山当地三七，选择一年生籽苗。土壤基本理化性质:pH值为5.3，w(有机质)为32.16 g·kg-1，w(全氮)为0.56 g·kg-1，w(全磷)为 1.69 g·kg-1，w(全钾)为 15.95 g·kg-1，w(碱解氮)为 91.25 mg·kg-1，w(速效磷)为 18.83 mg·kg-1，w(速效钾)为 99.51 mg·kg-1，w(Cd)为 0.30 mg·kg-1，按照GB 15618—2018《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准(试行)》，达到风险筛选值，应进行监测。

一年生籽苗移栽前土壤进行镉和石灰的处理:试验设置w(Cd2+)为6.0 mg·kg-1，采各个小区土样，自然风干，磨碎过筛后，称量各个小区1 kg表层土，精确称量3 m2所需 CdCl2·2.5H2O，与1 kg土壤均匀混合;设置4个石灰施用梯度:0、750、2 250、3 750 kg·hm-2，每个处理 3个重复。与 CdCl2·2.5H2O混合均匀的土和石灰分别与对应小区0～15 cm土壤充分混匀后，再铺回该小区表面，土壤平衡老化14 d后再移栽一年生三七籽苗。小区面积为3 m2，三七株行距为15 cm×15 cm，每个小区移栽120株三七籽苗。遮荫棚内光照为自然光照强度的18%左右，进行常规栽培管理。

三七成熟期(10月20日)每小区采集10株三七进行生物量、Cd含量、皂苷含量测定，同时采用抖土法采集相应根际土壤样品。植株充分清洗后，在105℃下杀青0.5 h，80℃下烘干至恒重，称重后用研钵磨碎过1 mm孔径筛后保存。土壤样品风干后过2 mm孔径筛，测定土壤有效态镉含量和pH值。同时，在田间采集5株三七后立刻放入液氮灌速冻，移入-80℃冰箱保存，测定酶活性。

1.2 指标测定方法

1.2.1 土壤有效态Cd含量与pH值

参考GB/T 23739—2009《土壤质量有效态铅和镉的测定原子吸收法》，称取过2 mm孔径筛的风干土壤样品5.00 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入25.00 mL DTPA提取剂〔0.005 mol·L-1DTPA、0.1 mol· L-1三乙酰胺 (TEA)、0.01 mol·L-1CaCl2〕，在室温(25℃左右)下放入振荡器(JBZL-08智能气浴恒温振荡器，常州普天仪器制造有限公司)振荡(280 r·min-1)2 h后取下，过滤后的滤液用火焰原子吸收分光光度计(Thermo ICETM 3300 AAS)测定土壤有效态Cd含量。

取过2 mm孔径筛的土样，水土质量比为2.5∶1，用pH计(ST3100-H，奥豪斯仪器有限公司)测定土壤pH值。

1.2.2 植物Cd含量的测定

准确称取0.2 g植物样品于三角瓶中，放入数粒玻璃珠，加10 mL混合酸〔V(硝酸)∶V(高氯酸)=4∶1〕，加盖浸泡过夜，然后加一小漏斗于电炉上进行消解，若变为棕黑色再加混合酸，直至冒白烟，消化液呈无色透明或略带黄色。放冷后用滴管将试样消化液滤入10 mL容量瓶中并定容至刻度，混匀备用，同时做试剂空白。用火焰原子吸收分光光度计(Thermo ICETM 3300 AAS，美国)测定植物Cd含量。

1.2.3 皂苷含量的测定

采用高效液相色谱法测定皂苷含量，参考《中华人民共和国药典(2015版)》。

(1)色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以水为流动相B进行梯度洗脱;检测波长203 nm。理论塔板数按三七皂苷R1峰计算应不低于4 000。流动相为乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱(A相0～12 min为19%，12～60 min为19%～36%;B相0～12 min为81%，12～60 min为81%～64%)。

(2)对照品溶液的制备:精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品及三七皂苷R1对照品适量，加甲醇制成每1 mL含人参皂苷Rg1 0.4 mg、人参皂苷Rb1 0.4 mg、三七皂苷 R1 0.1 mg的混合溶液。

(3)供试品溶液的制备:取样品粉末0.6 g，加入甲醇50 mL，称定质量后放置过夜，80℃水浴保持微沸2 h，放冷再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，取滤液。

(4)测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪(Thermo HPLC-ultimate 3000，美国)，测定皂苷含量。

1.2.4 SE、DS、P450和 GT活性的测定

准确称量样本鲜重，按照0.1 g鲜重加0.9 mL匀浆液进行匀浆，4℃条件下静置30 min，设定温度为4℃，以3 000 r·min-1离心5 min(离心半径为6 cm)，取上清液待用。分别用对应的ELISA检测试剂盒(OmniAb，美国)测定 SE、DS、P450和GT 活性。

1.3 数据统计分析

采用Microsoft Excel 2010软件进行数据处理。采用SPSS 19.0软件相关性和差异显著性统计分析，差异显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 施加石灰对Cd胁迫下三七生物量的影响

Cd胁迫下，与未施加石灰相比，添加750、2 250和3 750 kg·hm-2石灰显著增加了三七成熟期主根、剪口、须根和茎叶干重(P＜0.05)，其中三七的主根干重分别显著提高13%、28%和31%;施加2 250和3 750 kg·hm-2三七剪口干重分别显著增加50%和53%;施加3 750 kg·hm-2石灰三七茎叶和须根干重分别显著增加17%和49%。三七不同部位生物量在石灰施加量为3 750 kg·hm-2时达到最大(图1)。

2.2 施加石灰对Cd胁迫下土壤有效Cd含量和pH值的影响

从图2可知，Cd胁迫下，与未施加石灰相比，施加750、2 250和3 750 kg·hm-2石灰土壤有效Cd含量分别显著降低12.3%、27.1%和32.9%。施加2 250和3 750 kg·hm-2石灰土壤pH值显著增加(P＜0.05)。

图1 施加石灰对Cd胁迫下三七各部位生物量的影响Fig.1 Effect of lime on biomass of different parts of Panax notoginseng under Cd stress

图2 施加石灰对Cd胁迫下土壤有效Cd含量和pH值的影响Fig.2 Effect of lime application on soil available cadmium content and pH under Cd stress

2.3 施加石灰对Cd胁迫下三七Cd含量的影响

三七不同部位Cd含量排序为须根＞剪口＞茎叶＞主根。与未施石灰相比，Cd胁迫下施加750、2 250和3 750 kg·hm-2石灰处理三七的茎叶Cd含量分别降低8%、37%和54%，须根分别降低11%、32%和50%，剪口分别降低14%、35%和49%，主根分别降低23%、34%和45%(图3)。

2.4 施加石灰对Cd胁迫下三七皂苷含量及相关酶活性的影响

Cd胁迫下，施加2 250和3 750 kg·hm-2石灰处理成熟期三七主根Rg1、Rb1和R1含量与未施加石灰处理差异显著(P＜0.05)。与未施石灰相比，施加750、2 250和3 750 kg·hm-2石灰处理Rg1分别增加9%和14%，Rb1分别增加29%～55%，R1分别增加10%～31%(图4)。

从表1可知，随着石灰施加量上升，R1/(Rg1+Rb1)比值上升，Rg1/Rb1比值下降，与未施加石灰相比均存在显著差异(P＜0.05)。

6 mg·kg-1Cd胁迫下，施加750、2 250和3 750 kg·hm-2石灰与未施加石灰相比，三七主根鲨烯环氧酶(SE)活性分别显著提高18%、42%和61%，达玛烯二醇合成酶(DS)活性分别显著提高7%、28%和54%，三七主根细胞色素P450单加氧酶分别显著降低11%、21%和28%，糖基转移酶(GT)活性分别显著降低13%、33%和40%(P＜0.05)(图5)。

图3 施加石灰对Cd胁迫下三七各部位Cd含量的影响Fig.3 Effect of lime on cadmium content of different parts of Panax notoginseng under Cd stress

图4 施加石灰对Cd胁迫下三七单体皂苷含量的影响Fig.4 Effect of lime on saponins content of Panax notoginseng under Cd stress

表1 施加石灰对Cd胁迫下三七不同皂苷比值的影响Table 1 Influence of lime application amount on saponinsration of Panax notoginseng under Cd stress

图5 施加石灰对Cd胁迫下三七皂苷合成相关酶活性的影响Fig.5 Effect of lime on three kinds of saponins content of Panax notoginseng under Cd stress

Rg1、Rb1和R1与P450还原酶和糖基转移酶呈极显著负相关(P＜0.01，n=12)，Rg1、Rb1和 R1与DS和SE呈极显著正相关(P＜0.01，n=12)。

3 讨论

Cd胁迫不利于三七生长和生物量的积累，会使三七叶片发黄，植株矮小，主根生物量减少。有研究表明施石灰可降低水稻［23］、小麦［24］、油麦菜［25］对Cd的吸收，促进植物生长，提高植物生物量。Cd进入植物通常不取决于Cd的总含量，而与其活性或有效态Cd含量有关［26］。土壤中交换态Cd含量的多少是植物有效态Cd含量的基础，能被植物吸收的Cd形态受土壤等环境影响较大，土壤pH值是影响Cd迁移转化的重要因素［27］。随着施加石灰量的增加，土壤pH值显著增加，土壤有效Cd含量显著降低，这可能是随着pH值上升，Cd的溶解度降低，从而减缓了Cd在土壤中的迁移转化［28］;也可能是石灰为碱性物质，可调节土壤pH值，与土壤中各种物质发生反应。有研究表明，施加石灰可通过溶解作用释放出OH-，与CO2反应生成CO32-，碳酸根可与Cd离子生成难溶CdCO3［29-30］，随pH值升高，难溶性CdCO3含量增加，降低了土壤中Cd的植物可利用性。这与笔者试验中施加石灰能够降低三七中重金属残留量，提高Cd胁迫下三七生物量，降低三七中Cd含量的结论一致。

三七根中的次生代谢产物人参皂苷 Rg1、Rb1和三七皂苷R1是极其重要的3种药用活性成分。Cd胁迫下，三七药效成分的合成受到抑制［31］。张旭等［32］采用盆栽试验研究不同水平Cd污染土壤对板蓝根主要药用成分靛玉红的影响，发现随土壤中重金属Cd含量的增大，靛玉红含量降低。在该研究中，随石灰施加量的上升，三七不同皂苷单体含量上升。达玛烷型人参皂苷经历CYP450与GT多种氧化、羟基化、取代反应和糖基化反应生成原人参二醇人参皂苷Rb1和原人参三醇型人参皂苷Rg1和R1［33］。随着石灰施加量上升，Rg1/Rb1比值上升，原人参二醇Rb1转化为原人参三醇Rg1的速率增加，可能是因为施加石灰使得土壤pH值有利于三七不同皂苷的合成，三七总皂苷含量显著增加。三七皂苷R1是三七中特有的药效成分，Rg1和Rb1为人参皂苷，在其他药用植物中也存在。R1/(Rg1+Rb1)比值显著上升，说明随着施加石灰含量的上升，三七特有的皂苷种类三七皂苷R1含量增加。

Cd胁迫下，随着石灰施加量的上升，SE活性和DS活性均显著增加(P＜0.01，n=12)，但细胞色素P450活性和GT活性显著降低，3种皂苷含量与细胞色素P450还原酶和GT呈极显著负相关，与SE和DS呈极显著正相关(P＜0.01)。有研究表明，R1剂量依赖性抑制细胞色素P450活性，Rg1不抑制P450活性，Rb1 在浓度达 1 000 μmol·L-1时才轻微抑制细胞色素P450的活性［34］。R1对细胞色素P450的抑制作用呈浓度依赖性，随着R1浓度增加，酶活性增加［35］。随着R1含量的上升，P450活性降低，这可能是因为细胞色素P450有解毒作用，所以随着石灰施加量的上升，Cd胁迫对三七的毒害作用减小，细胞色素P450活性随之降低。SE是一种单加氧酶，催化鲨烯合成2，3-氧化鲨烯，是三萜皂苷和植物甾醇生物合成途径中的关键酶之一。DS是氧化鲨烯环氧酶中的一种，催化2，3-氧化鲨烯环化为达玛烯二醇。三七总皂苷(PNS)属于达玛烷型四环三萜皂苷，而达玛烯二醇是达玛烷型皂苷的前体，所以DS在三萜皂苷合成中起着重要的调节作用。随着石灰施加量的上升，SE和DS活性上升，不同施加量处理之间存在显著差异。施加石灰加速了三七总皂苷合成，参与三七总皂苷合成的酶活性也增强。施加3 750 kg·hm-2石灰最有利于三七的生长和三七药效成分的合成，但还没出现转折点，后续试验可以继续加大石灰施用量。