复合芽孢杆菌对鲫鱼养殖水体水质及细菌群落结构的影响

李 雪，刘述凤，鄢雨朦，张润洁，王天杰，付保荣

(辽宁大学环境学院，辽宁沈阳 110036)

我国是水产养殖大国，2017年全国水产养殖产量达4 792万t，占世界总产量的60%以上［1］。但高密度集约化养殖使得养殖水体营养盐N、P等浓度超标，容易引发鱼虾类传染性疾病，破坏养殖水体及周遭环境［2］。近年来，约40%的传统水产养殖区域被划入生态红线范围，寻找经济高效且无毒害的水质改良工艺成为研究的热点。

目前，用于水产养殖水体水质调控的物理化学方法主要包括增氧、换水、吸附、氧化还原法等，这些方法存在处理效果差、成本高、产生有毒副产物等缺陷［3-4］。利用生物自身代谢对养殖水体进行调控的生物方法主要包括引进水生植物、配养生态互补型水生动物、投加微生态制剂等。利用水生植物、水生动物调控具有一定风险性，易引起物种入侵，危及生态平衡。而微生态制剂具有改善水质、防治病害、无残留、成本低、安全性好等优势，被广泛应用于水产养殖［5］，并能有效减少水产养殖对抗生素的依赖［6-7］。且光合细菌［8］、硝化细菌［9］、反硝化菌［10］及芽孢杆菌［11-12］等在水产养殖水环境中改善效果较好。然而随着养殖水体污染因子趋于复杂化，单一菌种在脱氮除磷等方面存在一定局限性。利用各菌种之间的相互作用是目前为止水体净化较有效的方法。目前国内外将2种或2种以上具有特定作用的单一菌种做成复合制剂投加于养殖水体中，能形成发挥多种功能且稳定的微生物群体［13］。宋协法等［14］研究表明混合菌处理养殖污水的能力优于单菌种。

水体中微生物在营养元素循环、去除污染物、分解有机物、抑制病原菌等方面起着重要作用［15-17］，并且微生物群落结构变化能影响养殖水体水质及养殖生物的健康状况。因此，研究投加外源微生态制剂对养殖水体微生物群落结构的影响能从微观层面揭示微生物净化水质机理，提高水质净化效率［18］。但目前有关微生态制剂对鲫鱼(Carassius aumtus)养殖水体微生物群落结构影响的研究仍鲜见报道。笔者以鲫鱼为研究对象，研究复合芽孢杆菌对养殖水体营养盐(N、P)的改善情况，并利用16SrDNA高通量技术，分析投加菌种后养殖水体微生物群落结构的变化，探索其中对污染物降解起重要作用的功能性微生物，以期揭示微生态制剂的作用机理及微生物群落的动态演变规律，为微生态制剂改善养殖水体水质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，简称BS)和凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans，简称BC)购自辽宁华星生物科技有限公司，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium，简称A0)由实验室分离纯化得到，保藏号为CCTCC 13452。经培养稀释，菌液的活菌量为2.0×108cfu·mL-1。

1.2 试验设计及饲养管理

试验用鲫鱼、用水和底泥均取自沈阳某养殖池塘。水体水质参数:pH值为7.2，ρ(溶解氧)为7.65 mg·L-1，ρ(氨氮)为 1.34 mg·L-1，ρ(硝态氮)为0.18 mg·L-1，ρ(亚硝态氮)为 0.41 mg·L-1，ρ(总磷)为 0.204 mg·L-1。

选取质量为(60±3)g的健康鲫鱼180尾，随机分为对照组(CK)、复合芽孢杆菌A0+BS组(A0+BS)、复合芽孢杆菌A0+BC组(A0+BC)，每组3个重复，每个重复20尾鱼，在规格为100 cm×50 cm×60 cm的水族箱中进行室外试验。每个水族箱加180 L养殖水，水底加入10 cm厚底泥，氧气泵加氧控制水体溶解氧。试验期间水温为14～24℃，随环境温度变化，pH值为7.1～7.4。每天投喂2次饵料。

试验开始时，CK组添加540 mL无菌水，A0+BS组投加A0菌液、BS菌液各270 mL，A0+BC组投加A0菌液、BC菌液各270 mL。由于此种复合菌作用效果可以持续15 d左右，故时间设计为15 d，以探究复合菌作用期间各指标的变化。

1.3 试验方法

1.3.1 水质分析方法

每隔2 d取水样500 mL，经过滤后测定各水样的水质指标。采用水杨酸分光光度法(HJ/T 536—2009)测NH4+-N浓度，N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法(F-HZ-HJ-SZ-0031)测NO2--N浓度，紫外分光光度法(HJ/T 346—2007)测 NO3--N浓度，钼酸铵分光光度法(GB 1894—1989)测TP浓度［19］。

采用Origin 8.0和SPSS 19.0软件对数据进行处理分析。

1.3.2 DNA提取

经0.22 μm孔径聚碳酸酯膜负压抽滤，用灭菌的剪刀将滤膜剪碎，置于2 mL无菌离心管中，利用Soil DNA kit(OMEGA)试剂盒提取细菌总DNA。

1.3.3 高通量测序

对各样本环境基因组DNA中细菌16SrRNA V3-V4区进行扩增:引物为 341F(5"-CCTACGGGNGGCWGCAG-3")和805R(5"-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3")。PCR反应条件为94 ℃ 3 min、94 ℃ 30 s、45 ℃ 20 s、65 ℃ 30 s，5 个循环;94 ℃ 20 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s，20个循环;72℃ 5 min。PCR结束后，使用w=2%琼脂糖对扩增产物进行凝胶电泳检测。将各样品的PCR产物委托生工生物工程(上海)股份有限公司在Illumina-Miseq平台上进行高通量测序。

1.3.4 数据分析

为保证信息分析质量，使用Cutadapt 1.2.1软件去除引物接头;使用Pear 0.9.6软件进行序列拼接;使用Prinseq 0.20.4软件进行序列过滤;使用Mothur 1.30.1软件去除嵌合体序列，最后获得用于分析的优质系列。将相似性为97%的序列分成不同的操作分类单元(OTU)，采用QIIME 1.8.0软件对OTU进行Alpha多样性分析，包括Shannon指数(Ishannon)、Simpson指数(Isimpson)、Chao指数(Ichao)和ACE指数(IACE)，采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似度水平的OTU代表序列进行分类学分析，统计各样品门、属水平的群落组成。各指数计算方法如下:

式(1)～(7)中，Ichao为估计群落中含OTU数目的指数;Sobs为实际OTU数目;n1为只含1条OUT数目;n2为只含2条OUT数目;EAC为估计群落中OTU数目的指数;Sabund为多于abund条序列的OTU数目，其中abund为优势OTU的阈值，默认为10;Srare为含有abund条序列或者少于abund的OTU数目;为稀有物种变异系数的估算值;CEAC为各样品文库的覆盖率;Nrare为第i个OTU包含序列数与i乘积的累加和;Ishannon估算样品中微生物Shannon多样性指数;Isimpson为估算样品中微生物Simpson多样性指数;ni为第i个 OTU包含序列数;N为总OTU数。

2 结果与分析

2.1 复合芽孢杆菌对养殖水体N、P浓度的影响

前11 d各组NO2--N 浓度基本保持不变，随后A0+BS和A0+BC组NO2--N浓度下降，A0+BS组下降速率快于A0+BC组，试验结束时分别降低了76.3%和65.8%，与CK差异显著(P＜0.05)。前5 d CK组NO3--N浓度基本不变，5 d后急剧上升，9 d后趋于平缓;处理组7 d后NO3--N浓度不断上升。各处理组NO3--N浓度始终低于CK组，第9天处理组与 CK组差异最大，A0+BS、A0+BC和 CK组ρ(NO3--N)分别为 0.29、0.34 和 0.45 mg·L-1，A0+BS的处理效果优于A0+BC组。试验期间各组TP浓度整体先上升后下降，且前11 d A0+BC组TP浓度显著高于CK组(P＜0.05)，A0+BS组TP浓度显著低于CK组(P＜0.05)，第13天A0+BS组 TP浓度最低，与CK相比降低了80.3%。

2.2 复合芽孢杆菌对养殖水体微生物群落结构的影响

2.2.1 微生物群落多样性分析

如表1所示，统计3个组CK、A0+BC、A0+BS包含的OTU 数目分别为8 639、7 558、7 761，CK 组与A0+BC组、AO+BS组具有显著性差异(P＜0.05)。CK组与A0+BS组Shannon指数和Simpson指数具有显著性差异(P＜0.05)，且A0+BS组生物多样性最高。CK组与A0+BC组Chao指数和Ace指数具有显著性差异(P＜0.05)，且CK组物种总数最高。

Shannon稀释曲线可用来比较测序数据量不同的样本中物种的丰富度，也可用来说明样本测序数据量是否合理。如图2所示，当在0.97相似性水平下曲线趋向平坦时，说明测序数据量合理，更多的数据量只会产生少量新的OTU，反之则表明继续测序还可能产生较多新的OTU。从图中可看出相同序列数时A0+BS组的指数最大，群落多样性最高。

图1 养殖水体营养盐N、P浓度的变化Fig.1 Changes of N and P concentrations in culture water

表1 细菌群落丰富度和多样性指数Table 1 Bacterial community richness and diversity index

图2 Shannon指数稀释曲线Fig.2 Shannon index dilution curve

2.2.2 微生物群落组成

如图3所示，CK组在门分类水平上微生物群落结构具有较高的多样性，优势菌主要为厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和绿弯菌门(Chloroflexi)等，其所占比例分别达57.8%、25.3%、8.2%和3.7%;A0+BC和A0+BS组优势菌组成基本相同，变形菌门分别占90.4%和89.1%，拟杆菌门分别占5.7%和4.8%，放线细菌门(Actintobacteria)分别占2.2%和3.9%，其中变形菌门所占比例均最大。

如图4所示，3组水样中细菌覆盖了85个属，其中36个属相对丰度大于1%。CK组优势菌主要为赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、土壤芽孢杆菌属(Solibacillus)、血液杆菌属(Haematobacter)、弓形杆菌属(Arcobacter)、狭义梭菌属(Clostridium sensustricto)等，其中赖氨酸芽孢杆菌属和土壤芽孢杆菌属占比最大，分别为27.6%和9.5%;A0+BC组优势菌主要为丛毛单胞菌属(Comamonasin)、不动杆菌属(Acinetobacter)、未分类菌、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)，其中丛毛单胞菌属、不动杆菌属、寡养单胞菌属占比最大，分别为27%、14%和9.5%。A0+BS组优势菌主要为丛毛单胞菌属、寡养单胞菌属、柄杆菌属(Caulobacter)、嗜酸菌属(Acidovorax)、假黄色单胞菌属(Pseudoxanthomonas)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、硝化杆菌属(Bosea)、Dokdonella属、黄色单胞菌属(Thermomonas)等，其中丛毛单胞菌属和柄杆菌属占比最大，分别达8.1%和8.0%。

图3 3个水样门水平微生物群落结构组成分布Fig.3 Distribution of microbial community structure in three water samples

图4 3个水样属水平微生物群落结构组成分布Fig.4 Distribution of microbial community structure in three water samples

在属分类水平上，对3组水样相对丰度大于3%的优势菌进行方差分析(图5)。3组水样包括14个优势菌属，且均具有显著性差异(P＜0.05)，与A0+BC、A0+BS组相比，CK组优势菌赖氨酸芽孢杆菌属 (Lysinibacillus)、土壤芽孢杆菌属(Solibacillus)、狭义梭菌属(Clostridium sensustricto)、血液杆菌属(Haematobacter)有显著差异(P＜0.05);与CK、A0+BS组相比，A0+BC组优势菌丛毛单胞菌属(Comamonasin)、不动杆菌属(Acinetobacter)有显著差异(P＜0.05);与CK、A0+BC组相比，A0+BS组优势菌柄杆菌属(Caulobacter)、嗜酸菌属(Acidovorax)、Dokdonella属有显著差异(P＜0.05);A0+BC与A0+BS组之间寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、假黄色单胞菌属(Pseudoxanthomonas)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、硝化杆菌属(Bosea)无显著差异。

图5 属水平上优势菌相对丰度的差异性分析Fig.5 Difference analysis of relative abundance of dominant bacteria at the genus-level

3 讨论

3.1 复合芽孢杆菌的脱氮除磷作用

研究表明，微生态制剂能够分解和利用养殖水体中的残饵、排泄物，通过氧化、氨化、硝化、除磷、固氮等作用，降低水体中NH4+-N、NO2--N、NO3--N、TP浓度，抑制致病菌和有害菌［20］。常见的微生态制剂芽孢杆菌属好气性细菌，可以改善水质，促进水体的氮循环，降低NH4+-N、NO2--N等有害物质浓度，维持水生态平衡［21］。

鲫鱼排泄物及残余饵料经微生物分解，变成NH4+-N 等小分子无机物［22］，导致 NH4+-N浓度上升。当鱼体内NH4+-N含量超标时，会表现出致死效应［23］。试验前期，各组养殖水体中NH4+-N浓度逐渐升高，且处理组低于CK组，说明短时间内由于复合芽孢杆菌繁殖量少，微生物对残留饵料及鲫鱼排泄物分解产生的NH4+-N量超出了复合芽孢杆菌的降解能力，但2种复合芽孢杆菌对NH4+-N均有一定降解作用。5 d后由于复合芽孢杆菌增殖产生的胞外酶能把养殖水体中的有机质分解，引起处理组NH4+-N浓度下降，且复合芽孢杆菌A0+BS对NH4+-N的去除效果最佳。与试验周期为16 d的大薸-微生态制剂协同净化养殖水体NH4+-N变化情况一致［24］。NO2--N是NH4+-N转化成NO3--N的中间产物，对鱼类的毒害作用更强。由于复合芽孢杆菌可将NO2--N和NO3--N作为自身氮源进行生长繁殖［25］，使得各处理组 NO2--N浓度均显著低于CK组，且复合芽孢杆菌A0+BS对NO2--N的降解速率优于A0+BC组。张翠绵等［26］将枯草芽孢杆菌与巨大芽孢杆菌组成的复合菌剂投加于养殖池塘，发现NO2--N的去除效果显著。NO3--N对养殖生物的毒性比NH4+-N和NO2--N小得多，但是高浓度NO3--N也会对养殖生物的生长产生影响［27］。养殖水体来源于具备硝化功能的菌群对N及的转化。7 d后由于菌群的硝化能力超出了其对的利用率，引起各组NO3--N浓度上升，且处理组低于CK组，说明复合芽孢杆菌可将NO3--N作为氮源利用，与复合芽孢杆菌A0+BC相比，A0+BS对降解效果最优。张小平［28］研究发现在草鱼养殖池塘投加枯草芽孢杆菌和施氏假单胞菌混合而成的复合制剂后，一定时间内可有效降低养殖水体NO3--N浓度。

高浓度P在养殖水体中极易引起藻类的大量繁殖，造成水体富营养化。赵小蓉等［29］研究发现细菌在分解磷化合物的同时，一部分P被细菌同化，一部分以无机磷酸盐状态贮藏在细菌细胞内。试验前期养殖水体中的微生物将残余饵料、代谢废物分解，释放出各种形态的P，引起各组水体TP浓度上升。随着试验的进行，微生物大量繁殖，部分P被微生物同化、吸收，引起各组水体TP浓度下降。与CK组相比，A0+BS组对TP降解效果显著，而A0+BC组TP浓度始终高于CK组，可能由于凝结芽孢杆菌对TP同化吸收能力弱，导致微生物对饵料及代谢废物分解产生的TP超出复合芽孢杆菌A0+BC的聚磷能力。匡群等［30］发现巨大芽孢杆菌对TP具有强降解能力。付天玺［31］指出凝结芽孢杆菌对TP没有降解效果。邵乃麟等［32］将枯草芽孢杆菌投入鳝虾稻共作池塘后，TP去除效果显著。

经复合芽孢杆菌A0+BC、A0+BS处理后的养殖水体TP、NH4+-N浓度均低于GB 3838—2002《地表水环境质量标准》的Ⅲ级标准〔ρ(TP)≤0.2 mg·L-1，ρ(NH4+-N)≤1 mg·L-1〕，NO2--N和NO3--N浓度均符合 CAMARGO 等［33］和 ZWEIG 等［34］提出的鱼虾安全浓度〔ρ(NO3--N)≤10 mg· L-1，ρ(NO2--N)≤0.15 mg·L-1〕。笔者试验中，在投加微生态菌15 d后微生态菌大部分失活，对N、P营养盐的降解效果不显著，但与张小平［28］、王笃彩等［35］为维持养殖水体中一定的活菌数量，分别每隔7和3 d投加1次菌的研究相比，该微生态菌作用时间较长。因此，建议在实际养殖水体中，每隔13～15 d投加1次微生态菌，使养殖水体中N、P营养盐浓度处于达标状态。

3.2 复合芽孢杆菌对微生物群落结构的影响

通过分析3个组的多样性指数可知:CK与A0+BS组之间差异显著，说明在养殖水体投加微生态菌可以增加微生物群落的多样性。高多样性种群有利于提高水生态系统的稳定性。郑佳佳等［36］将复合芽孢杆菌投入到草鱼养殖水体后发现水体菌群多样性增加。

通过在门、属分类水平上分析3个水样微生物群落发现，投加外源菌可改变原有群落内部种群之间的竞争关系，导致优势种群的变更或产生部分对营养盐有抗性的微生物。复合芽孢杆菌可以快速改善水体中N或P，从而引发水体中微生态环境的变化，导致微生物群落结构的变化。陈琛等［37］研究发现，变形菌门、放线细菌门和拟杆菌门在凡纳滨对虾高位池养殖水体中丰度最高;ZHANG等［38］研究发现，在凡纳滨对虾淡水养殖水体中变形菌门、蓝细菌门、放线细菌门和拟杆菌门是水体微生物的主要类群。该研究A0+BS、A0+BC组变形菌门相对丰度增加。A0+BS组放线细菌门相对丰度最高，且A0+BS组硝态氮和氨氮浓度均低于A0+BC组和CK组。PHILIPPOT等［39］指出硝态氮和氨氮浓度与放线细菌门丰度呈负相关。另外，放线菌的生长能改善水体，抑制腐败菌等病原微生物的生长繁殖，转化N、P等元素［40］，与养殖水体N、P去除紧密相关。CK组的拟杆菌门相对丰度高于CK组，可能与CK组氨氮浓度较高有关。JIANG等［41］研究表明拟杆菌门丰度与氨氮浓度呈正相关。

在属的分类水平上，养殖水体微生物群落比较分散，多样性高。A0+BS组、A0+BC组的优势菌丛毛单胞菌属相对丰度最高，为异养硝化-好氧反硝化菌［42］，说明了存在同步硝化反硝化作用。苏婉昀等［43］指出与传统脱氨细菌相比，异养硝化-好氧反硝化菌在脱氮和去除有机物方面具有较大优势。A0+BC组优势菌不动杆菌属、假单胞菌属均为致病菌，危害鱼类健康［44］，其相对丰度均显著高于A0+BS组，说明投加复合芽孢杆菌A0+BS可有效减少致病菌。A0+BS组其他优势菌(硝化杆菌属、Dokdonella属)均属于生物脱氮菌，其中Dokdonella属是污水处理中常见的脱氮功能菌，具有硝化、反硝化作用［45］。

4 结论

复合芽孢杆菌A0+BS脱氮除磷效果最佳，处理后的养殖水体TP、NH4+-N浓度符合GB 3838—2002的Ⅲ级标准;同时增加了养殖水体微生物群落多样性，且优势菌大多数为脱氮功能菌，致病菌减少。表明投加芽孢杆菌可对养殖水体微生物群落结构进行调控，使养殖水体水质得到改善。根据 NY 1109—2006《微生物肥料生物安全通用技术准则》中的菌种安全分级目录，枯草芽孢杆菌与巨大芽孢杆均属于免作毒理学试验的菌种，确保了两者的安全性，可以直接投加使用。并且复合芽孢杆菌A0+BS在试验中表现出作用时间较长，无二次污染的优点。因此，复合芽孢杆菌A0+BS在养殖水体净化方面具有潜在应用价值。