玫瑰花 玫瑰茄 枸杞子复合发酵液化学成分的HPLC-HRMS分析△

王喻淇，梅晓丹，李洁，刘子菡，马涛，林峰，*，张加余

1.滨州医学院 药学院，山东 烟台 260040；2.北京中医药大学 中药学院，北京 102488；3.江苏菌钥生命科技发展有限公司，江苏 盐城 100176

许多药用植物富含黄酮、多糖、皂苷和有机酸等多种有效成分。现代研究也已证明，这些有效成分具有提高免疫力、抗疲劳、抗衰老等调节人体机体平衡的功效[1-3]。传统中药凭借其丰富的药效成分、广泛的药用资源和源远流长的“药食同源”文化，在为中药类产品研发提供基础的同时也已成为药物开发的化学资源库。已有研究表明，利用微生物发酵转化的方法可以增加中药活性成分的含量，提高化合物结构多样性，有利于有效成分转化成活性更好的物质，从而发挥更强的药理作用[4-5]。因此，通过微生物发酵传统中药已成为当前的研究热点。

玫瑰花RosarugosaThunb.又称刺玫花、穿心玫瑰等，属于蔷薇科植物。而重瓣红玫瑰是一种在中国被广泛食用的玫瑰，花瓣香甜、极具芬芳，被誉为“中国传统玫瑰的代表”，其具有行气解郁、疏肝理气、活血散瘀等多种功效[6-7]。玫瑰茄HibiscussabdariffaL.又名洛神花、红果梅以及红角葵等，为锦葵科1年生草本植物，素有“植物红宝石”的美誉，富含大量的有机酸，例如木槿酸、柠檬酸和原儿茶酸等。其中，木槿酸作为玫瑰茄花萼中所含的1种特殊物质，对心脏病、高血压、动脉硬化等有很好的疗效[8-9]。枸杞子LyciumbarbarumL.又称枸杞红实，属于茄科植物，是我国传统的补益类名贵中药。枸杞子除了含有脂肪、蛋白质、维生素和矿物质等营养素外，还含有枸杞多糖、牛磺酸和甜菜碱等有效成分，具有滋补肝肾、益精明目、润肺止咳和延缓衰老等功效[10-11]。

由于玫瑰花、玫瑰茄和枸杞子资源丰富，风味独特，且均具有“药食两用”功能，常被制成风味饮品供人们日常饮用。目前，市场上已出现以3者为原料的复合发酵饮品，然而其化学物质基础尚不明确。因此，本研究以玫瑰花、玫瑰茄和枸杞子为发酵底物，肠膜明串株菌肠膜亚种为发酵菌种，采用液态发酵技术将3者有机结合制成复合发酵液，并应用高效液相色谱-现行离子阱-静电场轨道阱质谱(HPLC-LTQ-Orbitrap MS)分析鉴定复合物提取液及发酵液中的化学成分，从而为玫瑰花、玫瑰茄和枸杞子的深度开发利用提供依据。

1 材料

1.1 仪器

Thermo Fisher DIONEX Ultimate 3000高效液相色谱仪与LTQ-Orbitrap XL质谱仪，配有电喷雾离子源(ESI)和Xcalibur 2.1工作站(美国Thermo Scientific公司)；R200D型电子分析天平(十万分之一，德国Sartorius公司)；Millipore Synergy UV型超纯水机(美国Millipore公司)；KQ-250 DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；BXM-30R 高压蒸汽灭菌锅(西安仪创实验室仪器设备有限公司)。

1.2 试药

玫瑰花、玫瑰茄及枸杞子药材购自亳州市华云中药饮片有限公司，经北京中医药大学张媛副教授鉴定为正品。质谱级甲醇、乙腈和甲酸购自美国Fisher公司，超纯水由Millipore Synergy UV型超纯水机制备。没食子酸、阿魏酸、槲皮素、原儿茶酸、芦丁和矢车菊-3-O-桑布糖苷等6种对照品购自成都曼思特生物科技有限公司，纯度均不低于98%。

2 方法

2.1 溶液配制

混合对照品溶液的制备：分别取上述6种对照品适量，精密称定，加入甲醇制成质量浓度约为100 μg·mL-1的储备液，用时稀释成浓度适宜的混合对照品溶液。

玫瑰花、玫瑰茄及枸杞子复合提取液的制备：取枸杞子10 g，加入200 mL纯净水浸泡30 min后，采用榨汁机进行均匀打浆，得到枸杞匀浆；取玫瑰花粉末40 g、玫瑰茄粉末20 g，精密称定，加入300 mL水，得到混合匀浆；将两者混合后搅拌均匀；加入K2HPO4调节pH至4.5～5.0；然后向混合液中添加2 g纤维素酶、2 g果胶酶，50 ℃下酶解90 min；加入NaHCO3等调节pH至5.8～6.0后加入20 g蛋白胨、80 g白砂糖，加入纯水定容至1000 mL。溶液在90 ℃条件下高压灭菌30 min后，以0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

玫瑰花、玫瑰茄及枸杞子复合发酵液的制备：复合提取液制备方法同上，待温度降至室温，接种肠膜明串株菌肠膜亚种发酵(培养温度25 ℃，发酵20 d)。取发酵后溶液过滤，滤液以0.22 μm微孔滤膜滤过，即得复合发酵液。

2.2 实验条件

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：0.1% 甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脱(0～10 min，5%B；10～16 min，5%～14%B；16～66 min，14%～51%B；66～70 min，51%～55%B；70%～75 min，55%～90%B)；流速：1 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2.2 质谱条件 ESI离子源，负离子检测模式；流动相经柱分流后进入质谱检测器的流速为0.3 mL·min-1；毛细管温度350 ℃；鞘气流速9 L·min-1；辅助气流速3 L·min-1；喷雾电压3.0 kV；毛细管电压-35 V；管透镜电压-110 V；源内碰撞诱导裂解池碰撞能量(CID)35%。样品采用高分辨全扫描(FT)，1级扫描分辨率为30 000，质量扫描范围m/z50～1200，隔离宽度2 Da；二级质谱采用数据依赖性扫描，选取上一级丰度最高的2个峰进行CID碎片离子扫描，激活能量单位0.25 q，激活时间30 ms。

2.3 数据处理

利用Xcalibur 2.1工作站进行数据处理，采用分子式预测模块预测所有母离子的分子式，相关参数设定为C[0～35]、H[0～50]、O[0～30]、环不饱和双键数(RDB equivalent value)[0～15]，质量精度误差在±5×10-6以内。

3 结果与讨论

本研究采用HPLC-LTQ-Orbitrap MS对玫瑰花、玫瑰茄、枸杞子复合物提取液发酵前后的化学成分进行分析鉴定。根据所获得的精确分子量，同时结合相应的色谱保留行为、质谱裂解规律、特征碎片离子、对照品比对以及相关文献报道，最终鉴定了48个化学成分，其中有6个化学成分可被准确鉴定，结果见图1。

图1 HPLC-LTQ-Orbitrap MS分析玫瑰花、玫瑰茄、枸杞子复合提取液发酵前后总离子流图

3.1 有机酸类成分的鉴定

有机酸类化合物均含羧基，在质谱裂解过程中易发生脱水和脱羰基反应。本研究从复合发酵液中鉴定的有机酸类化合物主要为绿原酸和小分子酚酸类。该类化合物是玫瑰花、玫瑰茄和枸杞子所共有的，具有抗炎、抗氧化、抑制血小板聚集等药理作用，对心血管疾病防治具有重要的临床价值[13]。本研究从复合物提取液中共鉴定出30个有机酸类化合物；从复合物发酵液中鉴定了35个有机酸类成分，结果见表1。

根据所获得的高分辨质谱数据，在保留时间2.63 min下，C1准分子离子峰[M-H]-为m/z207.014 53，计算其精确分子式为C6H8O8，相对分子质量为208.022 46 Da。在负离子模式下，二级碎片离子m/z189是由准分子离子峰脱去1分子水(18 Da)产生的。m/z189进一步丢失1分子CO2产生m/z127的二级碎片离子，故推测C1为木槿酸。

在保留时间4.77 min下，C2的准分子离子峰[M-H]-为m/z191.019 55，计算其精确分子式为C6H8O7，相对分子质量为192.027 55 Da。在负离子模式下，二级碎片离子m/z173是由准分子离子脱掉1分子水产生。m/z173继续丢掉1分子CO2生成m/z129碎片离子，继而再又丢失1分子水生成m/z111碎片离子，故可将C2鉴定为柠檬酸。

化合物 C3、C5、C6、C9、C10、C13和C14的准分子离子峰[M-H]-为m/z169.013 14，计算其精确分子式为C7H5O5，误差均小于5×10-6。经碰撞诱导裂解，m/z169丢失44 Da 产生m/z125[M-H-CO2]-的ESI-MS2基峰离子。结合对照品比对结果，可将C3准确鉴定为没食子酸，将其他6个化合物鉴定为没食子酸的同分异构体。

根据所获得的高分辨质谱数据，C4的准分子离子峰[M-H]-为m/z125.024 50，推断其精确分子式为C6H5O3，误差为4.43×10-6。其ESI-MS2谱产生特征离子m/z107[M-H-H2O]-和m/z97[M-H-CO]-，因此推测C4为5-羟甲基糠醛。

在保留时间11.34、23.95、32.76、38.76 min下，C7、C16、C25和C32均产生负离子模式准分子离子峰[M-H]-为m/z191.055 01(C7H12O6，误差≤ 5×10-6)。二级碎片离子m/z173由准分子离子m/z191脱掉1分子水产生；m/z173继续丢掉1分子水和1分子CO生成碎片离子m/z127，因此可将化合物 C7、C16、C25和C32鉴定为奎宁酸及其同分异构体。

化合物C8和C11准分子离子峰[M-H]-分别为m/z153.019 67和153.019 29，推断其最可能的分子式为C7H5O4，误差均小于5×10-6。其产生二级碎片离子m/z109[M-H-CO2]-和125[M-H-CO]-，故将其鉴定为原儿茶酸。并经对照品比对，确定化合物C11为原儿茶酸，并将C8鉴定为原儿茶酸的同分异构体。

在负离子模式下，化合物C12、C21和C30的准分子离子峰为m/z163.038 97[M-H]-。根据元素组成分析，推断它们的化合物分子式为C9H7O3。ESI-MS2谱主要的碎片离子有m/z145、135和119。其中，m/z145为母离子失去1分子H2O产生的；m/z135为母离子丢失1分子CO产生的，m/z119则是母离子丢失1分子CO2产生的。结合文献报道[13]，可推测化合物C12、C21和C30为对香豆酸及其同分异构体。

在保留时间23.83、34.70 min下，化合物C15和C28的准分子离子峰分别为m/z179.035 17和179.035 05(C9H7O4，误差≤±5×10-6)。通过碰撞诱导，m/z179产生了特征性碎片离子m/z135[M-H-CO2]-和m/z107[M-H-CO2-CO]-。因此，可推测化合物C15和C28为咖啡酸及其同分异构体。

根据所获得的高分辨质谱精确相对分子质量以及多级质谱碎片离子信息，推断化合物C17、C24和C29为单咖啡酰奎宁酸类化合物。它们的准分子离子峰[M-H]-为m/z353.086 70，误差均小于5×10-6，推断其最可能的分子式为 C16H17O9。单咖啡酰奎宁酸类化合物的ESI-MS2谱中多产生m/z191[quinic acid-H]-、179[caffiec acid-H]-和173[quinic acid-H-H2O]-等特征碎片离子。当咖啡酰基在奎宁酸母核上为4-位取代时，ESI-MS2谱的基峰离子为m/z173，因此化合物C29为隐绿原酸。当咖啡酰基在奎宁酸母核上为3-位和5-位取代时，它们的基峰离子均为m/z191，其中3-位取代时m/z179的丰度约为40%，5-位取代时m/z179的丰度约为 5%，与之前的文献报道一致[14]，由此可鉴定化合物C17为新绿原酸，化合物C24是绿原酸。

在负离子模式下，误差在±5×10-6范围内，化合物 C18、C19、C23和C27准分子离子[M-H]-均为m/z515.139 53，所有的元素组成为C22H27O14。根据所获得的高分辨质谱数据，化合物经碰撞诱导裂解后均减少162 Da，分别产生m/z353[M-H-caffeoyl/glu]-、335[M-H-caffeoyl/glu-H2O]-、191[quinic acid-H]-，表明化合物具有1分子葡萄糖基。因此，化合物 C18、C19、C23和C27推断为单咖啡酰奎宁酸葡萄糖苷。

在保留时间26.88、43.48 min，化合物C20和C37的准分子离子峰[M-H]-分别为m/z197.045 79和m/z197.045 90。根据元素组成分析，可推断化合物分子式为C9H9O5。m/z197产生了特征性碎片离子m/z182[M-H-CH3]-和m/z157[M-H-CO2]-，表明化合物具有1分子甲氧基。因此，可将化合物C20和C37鉴定为丁香酸。

根据所获得的高分辨质谱数据，化合物C22、C33和C34的准分子离子峰[M-H]-均为m/z337.091 79，误差均小于5×10-6，推断最可能的分子式为C16H17O8。它们的二级质谱主要特征碎片离子为m/z191[quinic acid-H]-、173[quinic acid-H-H2O]-和163[p-coumaric acid-H]-。根据文献报道[15]，当对香豆酰基的酯化位置在3、4或5位时，所产生的ESI-MS2基峰离子分别为m/z163、m/z173和m/z191，因此分别将C22、C33和C34鉴定为3-对香豆酰奎宁酸、5-对香豆酰奎宁酸和4-对香豆酰奎宁酸。

化合物C26和C31的准分子离子峰[M-H]-均为m/z193.049 53，根据所获得的高分辨质谱精确相对分子质量以及多级质谱碎片离子信息，推断最可能的元素组成为C10H9O4，误差均小于5×10-6。在ESI-MS2谱中，它们的准分子离子峰经碰撞诱导裂解后产生碎片离子m/z178，质量数减少15 Da，即丢失1分子甲基，同时丢失1分子CO2产生m/z149 的碎片离子，而m/z149进一步丢失1分子甲基产生m/z134的碎片离子。结合对照品比对，可确定化合物C26 为阿魏酸，鉴定化合物C31为阿魏酸或其同分异构体。

在保留时间42.38、42.94 min，化合物C35和C36的准分子离子峰分别为m/z367.103 88和m/z367.103 79，推断最可能的元素组成为C17H19O9，误差分别为4.14×10-6和3.89×10-6。通过碰撞诱导裂解后，m/z367产生了特征性碎片离子：m/z193[ferulic acid-H]-、191[quinic acid-H]-和173[quinic acid-H-H2O]-，故推断两者属于阿魏酰奎宁酸类成分。前期研究表明[16]，4-阿魏酰奎宁酸的MS2基峰离子为m/z173，5-阿魏酰奎宁酸的MS2基峰离子为m/z191，因此可推测化合物C35为5-阿魏酰奎宁酸，C36为4-阿魏酰奎宁酸。

在负离子模式下，误差在±5×10-6范围内，化合物 C38和C39准分子离子[M-H]-均为m/z300.997 89，元素组成为C14H5O8。根据所获得的高分辨质谱数据，化合物经碰撞诱导裂解后分别产生m/z300[M-2H]-、273[M-H-CO]-和257[M-H-CO2]-。因此可推测化合物C38和C39为鞣花酸或其同分异构体。

表1 HPLC-LTQ-Orbitrap MS 对玫瑰花、玫瑰茄、枸杞复合发酵液发酵前后有机酸成分的鉴定分析

续表1

注：*与对照品比对鉴定；+表示检出；-表示未检出；#表示该目标化合物或其同分异构体，下同。

3.2 黄酮类成分的鉴定

复合物中的黄酮类成分主要来自于玫瑰花和玫瑰茄，是以槲皮素或山柰酚为苷元的黄酮苷。黄酮糖苷类化合物的质谱裂解一般为糖苷键断裂，糖完全脱去后产生丰度最大的苷元离子，同时在ESI-MS2谱产生黄酮苷元开环裂解后的一系列碎片离子峰。结果表明，复合物经发酵后黄酮类成分由4种增加为6种，增加的2种均为黄酮苷元，分别是儿茶素和槲皮素，结果见表2。

根据所获得的高分辨质谱数据，化合物F1的准分子离子峰[M-H]-为m/z289.071 60，推断其最可能的分子式为C15H13O6，误差为1.38×10-6。化合物经碰撞诱导裂解后产生碎片离子m/z245[M-H-CO2]-，同时产生m/z203[M-H-C2H2O-CO2]-和m/z179[M-H-C2H2O-C3O2]-等特征碎片离子，结合对照品比对及文献报道[17]，确定化合物F1为儿茶素。

化合物F2和F4的准分子离子峰[M-H]-均为m/z609.145 01，根据所获得的高分辨质谱精确相对分子质量以及多级质谱碎片离子信息，推断最可能的元素组成为C27H29O16，误差分别为1.91×10-6和1.31×10-6。研究表明，芸香糖为鼠李糖基(1～6)葡萄糖基连接结构，经诱导裂解后，芸香糖苷类物质易直接失去芸香糖残基(308 Da)，产生[M-H-308]-离子。在化合物F2和F4的ESI-MS2谱中，它们的准分子离子峰经碰撞诱导裂解后产生m/z429[M-H-Glu-H2O]-、301[M-H-Rha-Glu]-、300[M-2H-Rha-Glu]-和255[M-H-Rha-Glu-H2O-CO]-等碎片离子。经对照品及文献[18]比对，化合物F4裂解途径与芦丁相似，其可能裂解途径见图2，因此推断化合物F4为芦丁，F2为其同分异构体。

在负离子模式下，化合物F5的准分子离子峰为m/z301.035 06，误差为2.59×10-6，元素组成为C15H9O7。化合物F5经诱导裂解后连续丢失1分子CO2和1分子H2O产生m/z273的基峰离子。结合对照品比对，可将F5准确鉴定为槲皮素。化合物F3的准分子离子峰为m/z463.087 10，推断其最可能的分子式为C21H19O12，其母离子经裂解后产生碎片离子m/z301，质量数减少162 Da，即丢失1分子葡萄糖残基。而m/z301离子进一步破裂产生的碎片离子与槲皮素一致，因此鉴定化合物F3为槲皮素-3-O-葡萄糖苷。

在保留时间71.37 min，化合物F6的准分子离子峰[M-H]-为593.129 82，根据元素组成分析，其分子式为C30H25O13。该离子在进一步的质谱裂解过程中丢失了308 Da，产生 ESI-MS2苷元基峰离子m/z285，表明其属于芸香糖苷。根据F6苷元离子进一步裂解产生的碎片离子，推断化合物F6为山柰酚-3-O-芸香糖苷。

3.3 花青素类成分的鉴定

花青素是一种存在于植物中的水溶性天然色素，安全性高，常用作食品的功能性天然色素，具有清除自由基、抗氧化、抗衰老、抑制痴呆症的发生和预防脑细胞变性等作用[19]。花青素是玫瑰花及玫瑰茄的主要生物活性成分之一，其主要包括飞燕草素和矢车菊素的糖苷。本实验从复合物提取液中鉴定了3个花青素类成分；从复合物发酵液中鉴定了2个花青素类成分，结果见表3。

在负离子模式下，化合物A1和A2准分子离子峰[M-H]-分别为m/z595.130 31和m/z595.130 55，保留时间分别为50.64、52.6 min，计算其精确分子式为C26H27O16，误差均小于5×10-6。在其ESI-MS2谱中，m/z595经诱导裂解后产生碎片离子m/z301，质量数减少294 Da，即丢失1分子桑布双糖(Sam)残基。同时，还进一步生成了m/z300[M-2H-Sam]-及255[M-H-Sam-H2O-CO]-等碎片离子，由此可将化合物 A1和A2鉴定为飞燕草素-3-O-桑布双糖苷。

图2 芦丁的裂解途径(负离子模式)

表2 HPLC-LTQ-Orbitrap MS 对玫瑰花、玫瑰茄、枸杞子复合发酵液发酵前后黄酮类成分的鉴定分析

表3 HPLC-LTQ-Orbitrap MS 对玫瑰花、玫瑰茄、枸杞子复合发酵液发酵前后花青素类成分的鉴定分析

同理，化合物A3的准分子离子峰[M-H]-为m/z579.135 93，推断它最可能的分子式为C26H27O15，误差为2.56×10-6。在其ESI-MS2谱中，m/z447离子中性丢失1分子桑布双糖残基，产生m/z285[M-H-Sam]-、284[M-2H-Sam]-和 223[M-H-Sam-CO2-H2O]-等碎片离子。结合对照品比对，可将A3准确鉴定为矢车菊素-3-O-桑布双糖苷。

4 结论

现代中药发酵研究是中药领域研究热点之一。前期研究发现，在发酵的过程中，发酵菌种通过产生多种酶类以及其他初级、次级代谢产物，对中药进行分解代谢，将许多人体不能直接吸收利用的大分子化合物降解成小分子化合物，并产生新的活性物质和新的功能[20]；或产生破壁酶对中药细胞进行破壁处理，促进有效物质的溶出，提高了其活性成分的浓度，有利于有效成分在人体的吸收和利用[21-22]。

本研究采用HPLC-LTQ-Orbitrap MS高分辨液质联用技术，对玫瑰花、玫瑰茄和枸杞子复合提取液和发酵液中的48种植物源性化学成分进行了筛选鉴定，其中包括39种有机酸、6种黄酮以及3种花青素类成分。结果表明，复合提取液经发酵后，各类成分种类及含量均发生不同程度的变化，如槲皮素及其糖苷衍生物。前期研究证明，脂溶性的槲皮素在胃部、小肠各段及结肠均可以被有效吸收，继而发生进一步的代谢转化[23]；槲皮素糖苷类物质的吸收则需要在体内水解酶(如乳糖根皮苷酶)的作用下去糖基化，释放出槲皮素再吸收[24]。本研究在玫瑰花、玫瑰茄和枸杞子复合提取液中仅检测到槲皮素-3-O-葡萄糖苷；而在发酵液中，既检测到槲皮素-3-O-葡萄糖苷，也检测到槲皮素，这可能是苷类成分在发酵菌种肠膜明串株菌肠膜亚种的作用下发生了水解，将糖苷类物质转化为小分子苷元，更利于有效成分在体内发生广泛的代谢和转化。综上所述，本研究为玫瑰花、玫瑰茄和枸杞子进一步开发利用提供了新依据，并对现代中药微生物发酵研究提供参考。