新型蛋白酶体抑制剂膝关腔内注射对兔骨关节炎的治疗作用及其机制

吴培刚，杨学栋，曹振昊，姜厚森，李忠

1潍坊医学院，山东潍坊 261000；2潍坊市人民医院

骨性关节炎(OA)是中老年人群中最常见的疾病，严重影响患者的身体健康和生活质量，近年对其研究越来越重视[1～7]。OA发生后，关节滑膜中的NF-κB功能增强，能够促进炎症因子的大量产生与释放，最常见有炎症因子如白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)[8～12]。同时，上述炎症介质及细胞因子均为NF-κB的诱导剂或激活剂，炎症因子会通过IL-1β/IκB激酶β(IKKβ)/核因子-κB(NF-κB)/基质金属蛋白酶-9(MMP9)通路进行信号转导来减轻炎症反应的过程，保护关节软骨[13,14]。新型蛋白酶体抑制剂(YSY-01A)是通过化学合成的一种新型的蛋白酶体抑制剂，具有很强的杀伤肿瘤细胞及抗乳腺癌的作用，机制是可以抑制肿瘤细胞的增殖，诱导细胞周期阻滞于G2/M期，并调节周期相关蛋白的表达[15～17]。本研究观察了YSY-01A对兔OA的治疗作用，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 主要药物 YSY-01A,由潍坊医学院药理学实验室合成并提供，纯度均在99%以上，溶于DMSO中，配制成浓度0.01 mol/L，-20 ℃保存。

1.2 实验动物及分组 健康成年新西兰大白兔36只，体质量2.5～3.0 kg，雌雄不限。将36只健康新西兰大白兔随机分为干预组、模型组、对照组各12只。

1.3 OA模型制备、YSY-01A给予方法 干预组、模型组均制备OA模型，即在严格无菌操作下，取5%氯胺酮2.0 mL，用生理盐水稀释至6.0 mL，以3 mL/1 000 g肌肉注射麻醉后，取仰卧位，将新西兰兔固定于操作台，剔除右后肢毛并消毒。由膝关节内侧处切开2.5 cm进入膝关节腔。膝关节稍屈曲，将髌骨推向一侧，切除前1/3内侧半月板、切断前交叉韧带。抽屉实验证明前交叉韧带完全断裂后，用大量生理盐水冲洗刀口，用1号丝线缝合切口，制模后每只样本连续3天腹腔注射4万U青霉素，饲养期间如有出现感染则该只大白兔突出实验，健康的大白兔补入各组。手术结束后，为防止实验动物之间因相互咬伤、攻击造成的不确定因素的增加，所有的动物标记后在标准饲养条件下单兔单笼饲养，注意保温和补液。制模1周后，干预组膝关腔内注射YSY-01A 1 mL，模型组和对照组膝关腔内注射0.9%生理盐水1 mL，每周2次，共8次，共4周。

1.4 兔膝关节软骨组织病理观察 制模后4周处死所有兔，手术切开膝关节腔，切取右侧股骨内侧髁处厚度约2 mm关节软骨，将取出的膝关节软骨组织立即进行4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片于-20 ℃冰箱保存。取出石蜡切片，室温静置15 min，经二甲苯脱蜡，梯度乙醇梯度脱水，HE染色6 min，盐酸乙醇分化30 s，后伊红液染色2 min。再次梯度酒精脱水，二甲苯石碳酸(3∶1)1 min，二甲苯(Ⅰ)、二甲苯(Ⅱ)各1 min，中性树脂封片。然后在光学显微镜下观察软骨细胞，并拍照记录。

1.5 兔滑膜组织IL-1β、TNF-α、TGF-β蛋白检测 取制模后4周处死兔的关节滑膜组织，行4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片于-20 ℃冰箱保存。采用免疫组化SP法检测滑膜组织IL-1β、TNF-α、TGF-β蛋白，具体步骤：将切片室温放置 15 min；正常山羊血清37 ℃封闭30 min，倾去多余血清，滴加兔抗兔IL-1β、TNF-α、TGF-β多克隆抗体(1∶200)，4 ℃过夜；滴加生物素化山羊抗兔二抗工作液，37 ℃孵育 60 min；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，37 ℃孵育60 min；DAB避光显色1～3 min。以上各步骤之间除山羊血清封闭外，均需用0.01 mol/L PBS冲洗。反应完毕后，切片行苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察,计数阳性细胞数，取平均值。

1.6 兔滑膜组织MMP9、NF-κB、IKKβ mRNA检测 取制模后4周处死兔的关节滑膜组织，TRIzol法提取组织总RNA，按逆转录试剂盒操作说明将2 μg总RNA进行逆转录和聚合酶链反应。PCR反应体系：Premix Taq 25 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，加灭菌双蒸水补足至50 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃、30 s，60 ℃(NF-κB、IKKβ)或56 ℃(MMP-9、GAPDH)、30 s，72 ℃、30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳，利用Gel图像分析系统分析电泳条带，以目的基因与内参GAPDH基因条带OD值比值表示目的基因相对表达量。

2 结果

2.1 各组兔膝关节软骨病理变化 对照组：软骨表面排列平滑、整齐，软骨细胞层次清楚，排列规则，潮线流畅(图1A)；模型组：软骨表面可见缺损，局部裂隙伸入下方，软骨细胞层次不清，细胞呈重度的弥漫性增生，结构紊乱，增厚钙化，潮线模糊(图1B)；干预组：各层结构相对于模型组好转，分层比价清楚，软骨细胞轻、中度增生，呈现多层次潮线(图1C)。

注：A为对照组，B为模型组，C为干预组。

图1 各组膝关节软骨病理变化

2.2 各组兔关节滑膜组织中IL-1β、TNF-α、TGF-β蛋白阳性细胞数比较 兔关节滑膜组织中IL-1β、TNF-α、TGF-β蛋白阳性细胞数比较见表1。

表1 各组兔滑膜组织IL-1β、TNF-α、TGF-β蛋白阳性细胞数比较(个，

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

2.3 各组兔关节滑膜组织MMP9、NF-κB、IKKβ mRNA相对表达量比较 兔关节滑膜组织MMP9、NF-κB、IKKβ mRNA相对表达量比较见表2。

表2 各组滑膜组织MMP9、NF-κB、IKKβ mRNA相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

3 讨论

OA是一种常见于老年人的退行性关节疾病，严重影响患者的身体健康和生活质量，给家庭及社会带来了巨大的经济负担。OA临床上以慢性的关节疼痛、僵硬、骨性肥大、骨性摩擦音及活动受限最为常见，药物治疗中非类固醇类抗炎药通常被认为是治疗OA的首选的一线药物治疗[16]，但是长期使用非类固醇类抗炎药引起的不良反应[17]。关节软骨是OA发生、发展过程中最易侵犯的部位，软骨细胞是关节软骨内合成软骨基质的惟一细胞，对维持关节软骨的正常结构和功能至关重要。当软骨细胞受到炎症因子、机械应力等刺激时，会通过细胞内的信号转导途径，将信号传递给各种转录因子，从而调控软骨组织的发生、改建、内环境的稳定以及创伤修复等病理生理过程。YSY-01A是一种新型的蛋白酶体抑制剂，能抑制多种细胞的增殖和分化，具有很强的杀伤肿瘤细胞及抗乳腺癌的作用，机制是可以抑制肿瘤细胞的增殖，诱导细胞周期阻滞于G2/M期，并调节周期相关蛋白的表达，这与其能抑制CT-L、T-L、PGPH活性关系密切相关[18]，YSY-01A可能对兔OA起到基因治疗作用。

IL-1β由免疫细胞分泌合成，是IL-1最常见的亚型，其正常情况下滑膜细胞及软骨细胞内少量存在，关节炎发生时其含量会升高，与其受体特异性结合后参与多种信号的传导，从而引起一系列炎症级联反应[19]。TNF-α是在相关炎症反应中最早出现的炎症因子，通过刺激淋巴细胞、中性粒细胞，进而增加血管内皮细胞的通透性，并能促进其他细胞因子的产生。IL-1β、TNF-α 两者在OA的发生过程中，能加快软骨的破坏，软基质降解，促进软骨细胞的分化、再生。TGF-β是一种起重要调控作用的多效性细胞因子，加快软骨的自身修复，促进急性炎症消退及修复。目前的研究认为OA的预防及治疗可以通过抑制关节软骨组织中IL-1β及TNF-α的产生来进行[20]。大量研究表明，作为关节软骨内的要胶原成分的Ⅱ型胶原的含量高低与OA有密切。通过测量胶原蛋白的含量高低可以得知骨软骨破坏的程度，其含量与OA的进展存在相关性[21～23]。本研究发现，模型组和干预组中兔膝关节滑膜组织中IL-1β、TNF-α阳性细胞数高于对照组，但干预组膝关节滑膜组织中IL-1β、TNF-α阳性细胞数低于模型组，这说明YSY-01A能抑制滑膜组织中IL-1β、TNF-α表达。模型组和干预组关节滑膜组织中TGF-β阳性细胞数低于对照组，但干预组关节滑膜组织中TGF-β阳性细胞数高于模型组，这说明YSY-01A能促进TGF-β的表达。同时软骨的病理结果显示模型组软骨表面可见缺损，局部裂隙伸入下方，软骨细胞层次不清，细胞呈重度的弥漫性增生，结构紊乱，增厚钙化，潮线模糊，而行YSY-01A治疗的干预组相对于模型组各层结构分层相对清楚，软骨细胞轻、中度增生，呈现多层次潮线。

当IL-1β和其受体IL-R结合后，会激活相关信号传导通路，并进一步将信号传递给相对应的载体，并聚集IKK复合体，激活NF-κB复合体从而进入细核内，促进TNF-α、TGF-β、MMP9等诸多炎症因子基因表达。IL-1β-NF-κB通过正反馈作用，促使MMP9、TGF-β、TNF-α大量表达，大量产生的炎症因子通过直接细胞毒作用、收缩毛细血管破坏软骨细胞。同时MMP系统抑制MMP9从而可以减少对软骨基质的降解，IL-1β的激活是上述两种伤害软骨途径的关键。但是当YSY-01A在阻断IKKβ激活时，NF-κB复合体不能够通过核膜进入核内，抑制了IL-1β的基因表达，MMP系统受到抑制，最终减慢软骨的退化[24]，IL-1β/IKKβ/NF-κB/MMP9信号转导通路阻断与实验中兔软骨细胞降解速度明显减慢，软骨退变速率明显减慢密切相关。本研究显示，与对照组比较，干预组和干预组滑膜组织MMP9、NF-κB、IKKβ mRNA表达升高；与模型组比较，干预组滑膜组织MMP9、NF-κB、IKKβ mRNA表达降低。说明YSY-01A可以通过阻断NF-κB信号转导通路从而干预了软骨基质的降解，抑制软骨细胞代谢，阻断软骨细胞的凋亡，延缓软骨退变，缓解OA的进展。

总之，YSY-01A对兔OA有治疗作用，其机制可能是通过抑制IL-1β、TNF-α表达，增强TGF-β表达，进而阻断IL-1β/IKKβ/NF-κB/MMP9正反馈信号通路。