非小细胞肺癌组织中性别决定区Y框蛋白2、糖原合成酶激酶-3β表达观察

杨岳峰，王茜，刘利玲，李帅，李娟

1成都医学院，成都 610500；2成都医学院第一附属医院

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康，每年新增患者超过200万人[1]，其中女性患者增幅更加明显。根据组织类型的不同，将肺癌分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，后者约占80%[2]。近年来，尽管肿瘤的治疗不断取得进展，新的靶向药物相继上市，但NSCLC患者五年生存率仍低于20%[3]。性别决定区Y框蛋白2(SOX2)位于3q26.3-q27上，是性别决定区家族基因成员之一，其异常表达与肿瘤干细胞发生有密切联系，对肿瘤恶性生物学过程有促进作用[4,5]。糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是一种丝氨酸—苏氨酸蛋白激酶，能促进线粒体介导死亡内源性细胞凋亡和抑制死亡受体介导的外源性细胞凋亡[6,7]，与卵巢癌、胶质瘤等的增殖、分化有关[8,9]。研究认为，GSK-3β是NSCLC的主要负调控因子，表达缺失会促进肿瘤干细胞自我更新诱发肿瘤形成。但SOX2、GSK-3β在NSCLC中作用的相关性尚不明确。本研究观察了NSCLC癌组织中SOX2、GSK-3β的表达变化，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年1～12月西部战区总医院收治的NSCLC患者42例，男26例，女16例；年龄43～77岁，其中60岁19例、>60岁23例；低分化14例，中分化16例，高分化12例；组织学类型为腺癌25例，鳞癌17例；根据国际抗癌联盟(UICC)肺癌TNM分期系统第七版进行分期，Ⅰ期19例，Ⅱ期13例，Ⅲ期10例；肿瘤直径>3 cm者有15例，3 cm者27例；发生淋巴结转移15例，未发生淋巴结转移27例；有吸烟史22例，无吸烟史20例；侵犯被膜26例，未侵犯被膜16例。纳入标准：①所有组织标本均经病理科高级职称医师复阅切片，确诊为NSCLC(2015年WHO肺肿瘤组织学分类标准)；②入组患者术前均未行放、化疗或其他治疗；③一般情况可，无严重肝肾疾病。手术留取NSCLC组织及其对应癌旁组织(距肿瘤组织2.0 cm以上)各42例份(分别记为肿瘤组和癌旁组)，标本的获取提前与患者及其家属沟通获得其知情同意。

1.2 组织中SOX2、GSK-3β检测方法 采用免疫组化SP法。标本常规石蜡包埋，切片，切片厚3～4 mm，常规用二甲苯脱蜡、乙醇复水，用内源性过氧化物酶阻断剂(3%的过氧化氢)阻断内源性过氧化物酶活性，在微波炉中用柠檬酸盐缓冲剂进行抗原修复，抗原的位点充分暴露，用山羊血清恒温孵育封闭内源性非特异性抗原，加一抗SOX2(浓度1∶200，一般为50 μL/每片)，于4 ℃冰箱中过夜，加二抗试剂3(山羊抗兔型)、二抗试剂4(辣根霉标记链霉卵白素工作液)，DAB显色，染色及盐酸酒精分色，脱水透明，封片，癌旁正常组织作阴性对照。SOX2蛋白定位于细胞核，细胞核中出现棕色颗粒为阳性表达；GSK-3β蛋白位于细胞质中，细胞质中出现黄色颗粒为阳性表达。采用半定量计分法判断SOX2、GSK-3β的表达强度：以切片中阳性细胞染色深浅评分，无着色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；以切片中阳性细胞比例评分，随机计数5个高倍视野，阳性细胞数<5%计0分，6%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计4分；两计分相乘取平均值，均值<1为阴性，其余为阳性。

1.3 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验或Fisher确切概率法，两定性资料的关联性分析使用Pearson列联系数，等级资料的相关性分析采用Spearman等级相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组SOX2、GSK-3β阳性率比较 肿瘤组和癌旁组SOX2阳性率分别为73.8%、4.8%，GSK-3β阳性率分别为47.6%、100%，两组比较，P均<0.05(见图1、图2)。

图1 SOX2在鳞癌中的表达(×400)

图2 GSK-3β在腺癌中的表达(×200)

2.2 SOX2、GSK-3β表达与NSCLC临床病理特征的关系 结果见表1，由表1可知，SOX2表达与NSCLC分化程度呈负相关，GSK-3β表达与NSCLC是否发生淋巴结转移呈正相关(P均<0.05)。

表1 SOX2、GSK3-β表达与NSCLC临床病理特征的关系

2.3 NSCLC组织中SOX2、GSK-3β表达的相关性 NSCLC组织中SOX2与GSK-3β表达无相关性(P>0.05)。

3 讨论

肺癌是世界范围内恶性肿瘤死亡的首要原因，由于早期症状不典型，多数患者就诊时已处于晚期，导致其预后差。近年来，肺癌的早期诊断标志物、治疗靶点以及预后标志物成为研究的热点。肿瘤干细胞在肿瘤的发展中具有重要作用。研究发现，SOX2和 GSK-3β的表达与肿瘤干细胞的发生、发展密切相关。但目前关于SOX2和 GSK-3β在NSCLC中的表达情况少有报道，本实验希望探讨两者在NSCLC的表达及其临床意义。

干细胞转录因子SOX2是SOX家族成员之一，在胚胎干细胞发育过程中对维持胚胎干细胞特性和重编程起关键作用，与靶基因G结构域特异性结合调控细胞分化[10,11]。SOX2异常表达与肿瘤干细胞发生有密切联系，对肿瘤恶性生物学过程有促进作用。已证实在胰腺癌、结直肠癌、宫颈癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤中表达升高[12～15]。研究[16]发现，肿瘤的形成、转移、入侵过程会消耗干扰素跨膜蛋白1(IFITM1)，体内IFITM1缺少会使肿瘤受抑制，SOX2表达会一定程度弥补IFITM1缺乏，从而继续促进肿瘤的发生和发展。人类GSK-3β基因包含12个外显子，定位于1号外显子,基因产物为46 kD蛋白质，包含433种氨基酸。GSK-3β在细胞增殖、细胞周期的连续性，胚胎发育[17]及胰岛素反应[18]等生理过程中都具有重要作用，并与阿尔兹海默症及抑郁症发生有关。肿瘤方面，GSK-3β被认为是肿瘤潜在的调控因子，尤其是在Wnt/β-catenin信号通路中的调节作用被广泛认同，β-catenin进入胞核与含高迁移率组(HMG)特征性结构域的因子形成复合物促进Wnt信号靶基因转录，被异常激活的Wnt信号靶基因与细胞增殖活化异常及肿瘤形成有密切关系，胞核中β-catenin被GSK-3β磷酸化后可抑制这一过程[7,8]。SOX2与GSK-3β对肿瘤某些方面有相似的生物学效应。GSK-3β在Wnt/β-catenin信号通路中发挥作用被认为是其调控肿瘤的主要途径。SOX2通过ChIP结合在β-catenin的启动子区域上，对β-catenin发挥转录调控作用。

本研究显示，SOX2在NSCLC癌组织中阳性率为73.8%，在癌旁组织中阳性率为4.8%，SOX2在NSCLC癌组织中呈高表达,提示SOX2的异常调节可能在肿瘤的发生、发展中起重要作用。SOX2表达与NSCLC肿瘤分化程度有关，SOX2表达越高，肿瘤分化程度越低。而与患者性别、年龄、组织学类型、TNM分期、肿瘤直径、淋巴结转移、被膜侵犯均无关。因此，SOX2可能是NSCLC的始动因素之一并能影响肿瘤的分化。NSCLC组织中GSK-3β阳性率为47.6%，较癌旁组织的表达显著下调，推测其表达异常可能影响肿瘤的发生。GSK-3β表达与NSCLC淋巴结转移有关，提示其可能影响肿瘤的侵袭转移能力。利用两者在调控Wnt/β-catenin信号通路方面有平行关系可以解释当肿瘤正性调控因素(SOX2阳性、GSK-3β阴性)同时出现时肿瘤发生率明显高于同时不出现(38.1%和14.3%)，同时表达时生物学效应更强。本研究显示，NSCLC组织中SOX2和GSK-3β表达无相关性，可能与样本量偏少有关，尚需更大规模的进一步实验研究予以阐明。

总之，NSCLC组织中SOX2表达升高，GSK-3β表达降低，SOX2和GSK-3β的表达与NSCLC的发生发展可能有关，联合检测有望为NSCLC早期诊断及分析、靶向治疗和预测预后提供参考。