复方中药超微粉对人工感染致病性E.coli血清中免疫与生化指标的影响

李佩国，张召兴，李蕴玉，贾青辉，张香斋

(1.河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室，河北 秦皇岛 066604；2.河北旅游职业学院 畜牧兽医系，河北 承德 067000)

△Jointfirstauthors

鸡致病性大肠杆菌病是危害蛋、肉鸡主要传染性疾病之一，该病是由不同血清型的致病性大肠杆菌引起鸡一系列症状疾病的总称，该菌感染途径广泛，对不同日龄的鸡均有致病性，尤其是对雏鸡感染率和死亡率均较高，给养鸡业造成严重的经济损失[1-2]。E.coli是临床中主要人畜共患的病原菌，其血清型众多复杂，不同血清型的菌株之间缺乏免疫保护性，没有有效疫苗进行预防，抗生素成为防治鸡致病性大肠杆菌病主要的手段[3]。随着抗生素反复的使用，改变了E.coli的耐药机制，不仅产生很强的耐药性，还造成蛋、肉等畜产品中严重的药物残留，并威胁着人们的健康[4]。中药富含皂苷、多糖、黄酮等多种生物活性物质，这些活性物质可以动物体内细胞、组织及器官，在机体内通过种途径方式调节细胞、体液免疫机能，同时可以诱导细胞因子基因调控与表达，在抗菌、抗病毒、抗炎、调节免疫力等多方面起着重要的作用。许多研究表明了中药在蛋、肉鸡细菌性疾病具有良好防治效果，被广泛应用于蛋、肉鸡养殖业中[5-6]。中药由于细胞壁结构致密，普通的粉碎不能将其有效活性成分完全释放，影响中药在机体内生物利用，超微粉碎使中药有效活性成分完全释放，可以提高中药在肠道内生物利用率，因而提高药效，并弥补中药普通粉碎缺陷[7-8]。目前，国内关于复方中药超微粉对人工感染雏鸡致病性E.coli地方株后血清中免疫生化指标影响报道较少。因此，本试验选用致病性E.coli地方流行株，建立病理模型，进一步探讨复方中药超微粉对雏鸡人工感染致病性E.coli地方株后血清中免疫生化指标影响，为研究复方中药超微粉防治鸡致病性大肠杆病作用机理及临床应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物1日龄的健康海兰灰雏鸡300只，购于秦皇岛市金牧种鸡场，饲养至14日龄，选择体质量相近的健康鸡为试验所用。

1.2 主要试剂与仪器畜禽头孢噻呋钠(含量≥90%)购于天津市中升挑战生物工程有限公司；总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALB)、谷草转氨酶(GOT)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(T-CHO)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、溶菌酶检测试剂盒(LZM)等试剂盒均购于南京建成生物工程公司；免疫球蛋白IgG，IgM，IgA 等ELISA Kit试剂盒均购于Elabscience公司。超微量分光光度计(ND2000C型)由德国Thermo公司生产；Infinite酶标仪(M200PRO型)由TECAN公司生产；小型高速离心机(5804R型)由德国EPPENDOR公司生产；超微粉机(WK-150)由青州市精诚医药制造有限公司生产。

1.3 试验菌株计数临床中分离的雏鸡致病性E.coli地方流行株，其血清为O78，对14日龄雏鸡的半数致死量(LD50)为2.5×107CFU/mL，由河北省预防兽医学重点实验室保存。将试验菌株菌种室温复苏后，无菌条件下接种于伊红美蓝培养上，挑取单个菌落，接种于营养肉汤中复壮，培养置对数期，利用平板菌落计数法计数，调整菌液浓度为2.5×107CFU/mL。

1.4 试验中药制备根据鸡致病性大肠杆菌病的中兽医理论辨证观点，选择体外抑菌敏感单味中草药作为主药，再根据各种单味中药配伍中君、臣、佐、使的药理性质组合成中药复方制剂[9-11]，复方中药(白头翁20 g、白芍15 g、五倍子15 g、连翘10 g、蒲公英10 g甘草15 g、黄芪15 g、麦冬10 g、土茯苓10 g、当归5 g)，用普通粉碎机粉碎过筛，再用超微粉碎机粉碎过筛，通过测量复方中药超微粉的粒径，该制剂的粒径主要集中在 8.57～13.65 μm之间，符合中草药超微粉粒径的范围。

1.5 试验设计与测定指标参考文献[11]，采用单因素设计试验，将180只14日龄雏鸡随机分成6组，每个组3个重复，每个重复10只，1组为阴性对照，2组为阳性对照，3组为抗生素组，在基础日粮中添加1%头孢噻呋钠， 4～6组分别在基础日粮中添加1.5%、2.0%、2.5%复方中药超微粉，连续饲喂7 d。除1组外，于分组当天每只鸡攻E.coli2.5×107CFU，停药后继续饲养14 d。于试验的第7、14、21 天，每组随机抽取10只雏鸡采血分离血清。按照说明书测定血清中免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、TP、ALB、GLB、GPT、GOT、BUN、UA、TG、TC、LZM等免疫生化指标。

1.6 试验数处理采用SPSS19.0进行F值方差分析与多重比较，用P<0.05表示差异显著性。

2 结果

2.1 对雏鸡人工感染致病性E.coli后血清中免疫指标的影响

2.1.1血清中IgG含量 由图1可知，试验7 d，5、6组的血清中IgG含量显著高于2组(P<0.05)，与1、3、4组比较均差异性不显(P>0.05)；试验14，21 d，4、5、6组的血清中IgG含量均显著高于2、3组(P<0.05)，但与1组比较无显著差异(P>0.05)。

图1 各组鸡血清中IgG含量检测结果 1.肩标小写字母或者无字母表示差异不显著(P>0.05)；2.肩标小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。下同

2.1.2血清中IgM含量 由图2可知，试验7 d，5、6组血清中IgM含量显著高于2组(P<0.05)，与1、3、4组相比差异性不显著(P>0.05)；试验14，21 d，5、6组血清中IgM含量均显著高于2、3组(P<0.05)，与1、4组相比无显著差异(P>0.05)。

图2 各组鸡血清中IgM含量检测结果

2.1.3血清中IgA含量 由图3可知，试验7 d，各组血清IgA含量均差异性不显著(P<0.05)；试验14，21 d，5、6组血清IgA含量均显著高于2、3组(P<0.05)，与1、4组相比差异不显著(P>0.05)。2、3组之间以及4、5、6组之间均差异不显著(P>0.05)。

图3 各组鸡血清中IgA含量检测结果

2.2 对雏鸡人工感染致病性E.coli后血清中生化指标的影响

2.2.1血清中TP含量 由图4可知，试验7 d，1、6组血清中的TP含量显著高于2、3、4、5组(P<0.05)，4、5组的TP含量虽有升高趋势，但与2、3组比较差异不显著(P>0.05)；试验14 d，5、6组血清中的TP含量显著高于2、3组(P<0.05)，与1、4组相比差异性不显著(P>0.05)；试验21 d，4、5、6组血清中的TP含量均显著高于1、2、3组(P<0.05)，但1、2、3组之间以及4、5、6组之间的差异不显著(P>0.05)。

图4 各组鸡血清中TP含量检测结果

2.2.2血清中ALB含量 由图5可知，试验7 d，各组血清中的ALB含量均差异性不显著(P<0.05)；试验14 d，5、6组血清中的ALB含量显著高于2组(P<0.05)，与1、3、4组相比差异不显著(P>0.05)；试验21 d，5组血清中的ALB含量均显著高于2、3组(P<0.05)，与1、4、6组相比差异性不显著(P>0.05)。

2.2.3血清中GLB含量 由图6可知，试验7 d，1、6组血清中的GLB含量均显著高于2、3组(P<0.05)， 但与4、5组相比差异性不显著(P>0.05)。试验14、21 d，5、6组血清中的GLB含量均显著高于2、3组(P<0.05)，与1、4组相比差异性不显著(P>0.05)，而1、2、3、4组之间以及4、5、6之间的差异不显著(P>0.05)。

图5 各组鸡血清中ALB含量检测结果

图6 各组鸡血清中GLB含量检测结果

2.3 血清中GPT、GOT活性与TC、TG含量

2.3.1血清中GPT活性 由图7可知，试验7，21 d，5、6组血清中的GPT含量均显著低于2、3组(P<0.05)，与1、4组相比差异性不显著(P>0.05)；试验14 d，5、6组血清中的GPT含量均显著低于2、3、4组(P<0.05)，与1组相比差异不显著(P>0.05)。

图7 复方中药超微粉对雏鸡血清中GPT含量检测结果

2.3.2血清中GOT活性 由图8可知，试验7 d，5、6组血清中的GOT含量显著低于2、3、4组(P<0.05)，与1组相比差异不显著(P>0.05)；试验14，21 d，4、5、6组血清中的GOT含量显著低于2、3组(P<0.05)，与1组相比差异不显著(P>0.05)。

图8 各组鸡血清中GOT含量检测结果

2.3.3血清中TC含量 由图9可知，试验7 d，5、6组血清中TC含量均显著低于2、3、4组(P<0.05)，与1组相比差异不显著(P>0.05)；试验14，21 d，5、6组血清中TC含量均显著低于2、3组(P<0.05)，与1、4组相比差异不显著(P<0.05)。

图9 各组鸡血清中TC含量检测结果

2.3.4血清中TG含量 由图10可知，试验7 d，5、6组血清中TG含量均显著低于2、3、4组(P<0.05)，与1组相比差异不显著(P>0.05)；试验14，21 d，4、5、6组血清中TG含量均显著低于2、3组(P<0.05)；与1组相比差异不显著(P>0.05)。

2.4 血清中BUN和UA的含量

2.4.1血清中BUN含量 由图11可知，4、5、6组各期的血清BUN含量虽然呈降低趋势，但与1、2、3组比较未达到差异水平(P>0.05)。

2.4.2血清中UA含量 由图12可知，试验7 d，各组血清中UA含量均差异性不显著(P>0.05)；试验14，21 d，5、6组血清中UA含量均显著低于2、3组(P<0.05)，与1、4组相比差异不显著不显著(P>0.05)。

图10 各组鸡血清中TG含量检测结果

图11 各组鸡血清中BUN含量检测结果

图12 各组鸡血清中UA含量检测结果

2.5 血清中LZM的含量由图13可知，试验7 d，5、6组血清中LZM含量均显著高于2、3、4组(P<0.05)；与1组相比差异不显著(P<0.05)；试验14 d，5、6组血清中LZM含量均显著高于1、2、3、组(P<0.05)，与4组比较无显著差异(P>0.05)；试验21 d，4、5、6组血清中LZM含量均显著高于1、2、3组(P<0.05)，而1～3组之间以及4～6组之间的差异不显著 (P>0.05)。

图13 各组鸡血清中LZM含量检测结果

3 讨论

3.1 复方中草药超微粉对雏鸡血清中免疫指标影响免疫球蛋白IgG、IgM、IgA是介导体液免疫的主要的蛋白活性物质，在机体的免疫应答中起着重要的作用，是评价动物机体的免疫机能的重要的指标之一[12-13]。王晓姗[14]和高俊波等[15]研究表明,复方中药可以提高鸡血清中免疫球蛋含量。本试验结果表明，与阳性对照和抗生素组相比，添加2.0%和2.5%复方中草药超微粉可使人工感染致病性E.coli后的血清IgG、IgM、IgA含量显著高于阳性对照和抗生素组，与阴性对照无显著差异。这可能是复方中药经超微后，使之有效成分溢出，刺激体内T细胞生成、活化，促进T细胞转化成浆细胞分泌抗体，提高机体免疫机能，抵抗外界致病性E.coli感染。

3.2 复方中草药超微粉对雏鸡血清生化指标的影响

3.2.1对血清TP、ALB、GLB含量的影响 动物机体的TP含量主要包括ALB和GLB，ALB主要作用维持渗透压、调节代谢和运输营养物质，GLB主要引起炎性反应，抵抗外来的病原微生物，因此血清中TP水平是评价动物物质代谢、免疫机能重要指标之一[16-17]。相关研究表明，雏鸡感染致病性E.coli后，可以造成不同程度的肝脏内皮网状组织和肝细胞损伤，并形成肝周炎，影响GLB和ALB合成与分泌，从而影响营养物质代谢和免疫机能[18-19]。本试验结果表明，与阳性对照组和抗生素组相比，2.0%和2.5%添加组可提高雏鸡人工感染致病性E.coli后血清中TP、ALB和GLB水平，且与正常雏鸡血清中TP，ALB和GLB无明显差异。由于复方中药中有效成分可以改善和修复致病性E.coli造成肝脏不同的损伤，提高肝脏代谢水平和免疫机能状况。与索朗扎西等[19]报道的一致。

3.2.2对血清GPT、GOT活性与TC、TG含量的影响 GPT和GOT存在动物肝脏中肝细胞及其他细胞线粒体内，与机体的物质代谢有关，由于某种因素导致肝脏受到损伤时，可使血清中的GPT和GOT的活性增强，血清中的GPT和GOT的水平是评价肝脏功能重要指标[20]。肝脏是机体内脂类主要的代谢器官，动物体内脂类物质主要来源于饲料和肝脏的合成，其中TC主要由肝脏合成贮存于肝脏，参与体内激素合成和物质代谢，当肝脏受到损伤时，体内的脂类物质代谢障碍，血清中的TG和TC含量就会增高[21-22]，并严重影响动物的生产性能[23]。本试验结果表明，与阳性对照组及抗生素比较，添加2.0%和2.5%复方中草药超微粉可显著降低雏鸡人工感染致病性E.coli后7，14，21 d血清GPT、GOT、TG和TC的含量，从而证实了该制剂可以改善雏鸡人工感染致病性E.coli后的肝功能，对肝脏的损伤具有修复的作用，改善雏鸡体内脂类的代谢水平，从而促进雏鸡的生长。其结果与索朗扎西等[19]、官丽辉等[20]等、姜贺等[24]报道的一致。

3.2.3对血清BUN和UA含量的影响 肾脏是禽类主要的排泄器官，其蛋白质、氨基酸等营养物质最终的代谢产物以尿氮、尿酸的形式排除体外，BUN和UA是机体内蛋白质及氨基酸代谢产物，当肾功能不正常时，血清中BUN和UA浓度就会升高，因此，BUN和UA是反映肾功能的主要指标[25]。张立永[26]研究表明，复方中药可以降低雏鸡感染E.coli后的血清中BUN含量。本试验结果表明，添加2.0%和2.5%复方中草药超微粉可减低人工雏鸡感染致病性E.coli后血清中BUN和UA含量，与阴性对照组无明显现差异，其中UA最为明显，与阳性对照和抗生素比较达显著水平，从而减少对肾脏的损伤，提高肾脏的代谢水平。

3.2.4雏鸡血清中LZM含量的影响 溶菌酶(LZM)是由动物体内多种吞噬细胞合成或分泌的一种具有较强抗菌活性的蛋白质，对外来的病原微生物通过吞噬细胞的吞噬和包裹后，将其直接杀死水解消化后排出胞外[27]。LZM具有抗菌广谱、抗菌活性稳定等多种优点，对大肠杆菌、伤寒沙门菌等病原菌具有直接溶解杀灭作用，同时还可以刺激机体产生补体及IgA，对病原菌进行间接溶解与杀灭[28]。张建[29]研究表明，复方中草药制剂能提高雏鸡血清中的LYZ的含量。邱妍等[30]研究表明，复方中药可以提高免疫抑制状态下小鼠血清中LYZ的含量。本试验结果表明，添加2.0%和2.5%复方中草药超微粉可使雏鸡人工感染致病性E.coli后4，14，21 d的血清中LYZ含量显著升高，从而提高机体的杀菌或者抗菌能力，抑制或杀死者外界入侵的致病性E.coli，同时也提高雏鸡的抵抗力。