肉桂油口服液抗沙门菌感染的保护作用分析

娄 飞，张 勇，王建锋，邓旭明*

(1.吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 130062；2.河南牧业经济学院 动物医药学院，郑州 河南 450046)

沙门菌为一种重要的人兽共患病源菌，在世界范围内已出现了多种耐药性菌株[1-4]，直接威胁着人类公共及食品安全[5-7]。沙门菌主要通过食源性传播的形式感染人类及动物，引起一些相关的胃肠道疾病，严重者可导致系统性感染。抗生素的使用诱导细菌耐药性的产生。因此，目前迫切需要一种新的抗感染策略去解决日益严重的耐药性问题。

沙门菌主要拥有2套毒力系统SPI1和SPI2[8-9]。毒力岛1在沙门菌入侵宿主细胞的过程中，发挥着重要的作用[10-12]。毒力岛2在沙门菌寄居宿主细胞的过程中，发挥着重要的作用[14-16]。Ⅲ型分泌系统(T3SS)在革兰阴性细菌中保守存在，并且在细菌感染宿主的过程中发挥着关键作用[17-18]。由于T3SS并不是细菌生长所必需基因[19-20]，通过抑制T3SS的功能，在不影响细菌生长的情况下，通过机体免疫防御系统将细菌从体内清除。所以，在沙门菌感染的过程中，以T3SS为药物靶标，能够达到抗沙门菌感染目的。

目前，已有相关文献报道多种小分子能够抗沙门菌感染，以T3SS为药物靶标，达到抗沙门菌的报道较少。肉桂油口服液作为临床常用药，成本较低，易于提取，且药理活性多样。目前，肉桂油口服液抗沙门菌感染的体内药理活性分析未见报道。

1 材料与方法

1.1 药物、细菌及试验动物肉桂油口服液(含肉桂油以桂皮醛计，每1 mL不低于100 mg，由本实验室制备)；药物溶剂，不含肉桂油的辅料溶剂；雌性BALB/c小鼠(6～8周龄)购自辽宁长生生物技术有限公司；鼠伤寒沙门菌SL1344由普渡大学罗招庆教授馈赠。

1.2 肉桂油口服液制备及含量测定取柠檬酸0.3 g，用少量水溶解后，用丙二醇150 mL，磁力搅拌至完全溶解后，依次加入肉桂油120 g、聚山梨酯-80为20 g、PEG400为650 mL，搅拌完全后，加入纯净水至总体积1 000 mL，5%柠檬酸控制溶液pH值在5.0～7.0范围内，过滤，灌装即得。

使用HPLC液相色谱仪，以对照品为参照，测定肉桂油口服液在液相色谱仪中的峰面积，按照外标法计算峰面积，即得。

1.3 测定沙门菌半数致死量挑取单克隆沙门菌至LB液体培养基内，过夜培养，次日1∶20扩大培养至对数期后，经口灌服感染小鼠。将50只BALB/c雌性小鼠，平均分为5组，分别为PBS组和不同感染菌量组(1×106，5×106，1×107，5×107CFU/只)。10 d观察期内，每天记录小鼠的死亡率。

1.4 小鼠感染沙门菌后的治疗剂量的确定按照方法1.3中确定的半数致死剂量，将30只BALB/c雌性小鼠平均分为3组，分别灌服给予高(200 mg/kg)、中(100 mg/kg)、低(50 mg/kg)3个治疗剂量的肉桂油口服液，8 h/次，在10日观察期内记录不同治疗组小鼠的死亡率。

1.5 死亡率统计分析将40只BALB/c雌性小鼠随机分为4组，每组10只，分别为健康对照组、沙门菌感染组、沙门菌感染+药物溶剂组(药物溶剂与沙门菌混悬液)、沙门菌感染+肉桂油口服液组。试验前，使用含链霉素饮用水预处理小鼠3 d，不同感染组(沙门菌感染组、沙门菌感染+溶剂组、沙门菌感染+肉桂油口服液组)，每只小鼠口服给予5×106CFU 的菌量。每只小鼠感染5×106CFU的细菌量。沙门菌感染+溶剂组和沙门菌感染+肉桂油口服液组，感染前1 d分别给予溶剂和肉桂油口服液，每次药物给予时间间隔为8 h，药物剂量为每次100 mg/kg。10日观察其内，每天记录小鼠死亡数量。

1.6 体质量指标的监测按照1.5的试验分组及给药方案，细菌感染剂量调整为106CFU/只，在10 d 治疗期间内每天称量每只小鼠的体质量，分析小鼠的体质量变化情况。

1.7 盲肠组织病理学分析及炎症细胞因子测定按照1.5的试验方法。感染后5 d处死小鼠，剪取部分盲肠组织，使用PBS冲洗干净后，将其浸泡于4%甲醛中固定组织，经脱水、透化、包埋、切片及HE染色并晾干后，显微镜下观察不同处理组盲肠的组织病理学变化。将剩余的盲肠组织研磨后制备10%组织匀浆液，5 000 r/min离心5 min。ELISA法检测上清中IL1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α含量。

1.8 数据处理组间差异显著性分析使用SPSS 19.0软件。*表示差异显著用，P<0.05；**表示差异极显著，P<0.01。

2 结果

2.1 肉桂油口服液含量肉桂油口服液含量测定对照品及样品色谱图如图1，2所示，经检测肉桂油口服液中桂皮醛的含量为100.02 g/L。

2.2 沙门菌感染小鼠攻菌量和肉桂油口服液治疗剂量的确定

2.2.1沙门菌感染小鼠攻菌量的确定 结果图3所示。不同感染剂量(5×106，1×107，5×107CFU/只)灌胃小鼠后，小鼠在10日观察期内全部死亡；1×107CFU/只感染组小鼠在感染后7 d、5×107CFU/只感染组小鼠在感染后4 d全部死亡，5×106CFU/只的感染组小鼠在感染后9 d全部死亡；1×106CFU/只的感染剂量并不导致小鼠死亡(10日观察期内)，因此本试验选用5×106CFU/只的感染剂量用于致死率统计分析，选用1×106CFU/只的感染剂量用于其他试验目的的统计分析(图3)。

图1 肉桂油口服液对照品HPLC色谱图

图2 肉桂油口服液样品HPLC色谱图

图3 沙门菌的感染剂量对小鼠死亡率的影响 1. PBS组，小鼠给予PBS；2. 1×106组，以1×106 CFU细菌/只攻菌量感染小鼠；3. 5×106组，以5×106 CFU细菌/只攻菌量感染小鼠；4. 1×107组，以1×107 CFU细菌/只攻菌量感染小鼠；5. 5×107组，以5×107 CFU细菌/只攻菌量感染小鼠

2.2.2肉桂油口服液治疗剂量的确定 基于2.2.1的结果，以5×106CFU/只感染菌量灌胃感染小鼠并同时分别给予高剂量(200 mg/kg)、中剂量(100 mg/kg)和低剂量(50 mg/kg)肉桂油口服液，在10日观察期内，低剂量组(50 mg/kg)对不能显著降低感染小鼠死亡率(P>0.05)，中剂量(100 mg/kg)和高剂量(200 mg/kg)均可显著降低感染小鼠的死亡率，与中剂量(100 mg/kg)组相比，高剂量(200 mg/kg)组对小鼠死亡率的影响并无显著性的提升，因此本试验选用中剂量(100 mg/kg)进行后续试验(图4)。

2.3 肉桂油口服液降低沙门菌感染小鼠的死亡率如图5所示，与溶剂对照组和无药物处理对照组相比，100 mg/kg肉桂油口服液治疗后可显著降低鼠伤寒沙门菌SL1344感染小鼠死亡率，表明肉桂油口服液可降低沙门菌感染小鼠死亡率。

2.4 肉桂油口服液逆转沙门菌感染小鼠体质量下降的趋势如图6所示，鼠伤寒沙门菌感染组和鼠伤寒沙门菌+溶剂组小鼠体质量一直处于下降趋势，经肉桂油口服液治疗后，随着药物治疗时间的延长，感染小鼠的体质量呈现逐渐上升的趋势，表明肉桂油口服液治疗可逆转沙门菌感染小鼠体质量下降的趋势。

2.5 肉桂油口服液缓解沙门菌感染小鼠盲肠病理性损伤组织病理学检查结果发现，感染组和感染+溶剂组小鼠盲肠上皮细胞层出现严重溃疡现象，肠壁和黏膜下层间隙增宽，大量的炎性细胞浸润于间隙中间。但感染小鼠经肉桂油口服液治疗后，小鼠盲肠组织病理变化并不明显，与空白组小鼠盲肠病理组织形态相似(图7)。

2.6 肉桂油口服液缓解沙门菌感染小鼠盲肠的炎性反应如图8所示，鼠伤寒沙门菌感染+肉桂油口服液组小鼠盲肠细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ)的含量极显著地低于细菌感染组和细菌感染+药物溶剂组，表明肉桂油口服液能够显著降低沙门菌感染小鼠盲肠炎症因子含量，可有效缓解沙门菌感染小鼠盲肠的炎性反应。

图4 不同剂量肉桂油口服液对沙门菌感染小鼠死亡率的影响 1. 仅感染组，以5×106 CFU细菌/只攻菌量感染小鼠；2.50 mg/kg组，以5×106 CFU细菌/只攻菌量感染小鼠，同时给予 50 mg/kg肉桂油口服液； 3. 100 mg/kg组，以5×106 CFU细菌/只攻菌量感染小鼠，同时给予100 mg/kg肉桂油口服液；4. 200 mg/kg组，以5×106 CFU细菌/只攻菌量感染小鼠，同时给予200 mg/kg肉桂油口服液

图5 肉桂油口服液(100 mg/kg)对沙门菌感染小鼠死亡率的降低作用 1.健康对照组，小鼠无细菌感染；2.细菌感染组+肉桂油口服液，以5×106 CFU细菌/只攻菌量感染小鼠，同时给予100 mg/kg肉桂油口服液；3.细菌感染组，以5×106 CFU细菌/只攻菌量感染小鼠；4.细菌感染组+药物溶剂，以5×106 CFU细菌/只攻菌量感染小鼠，同时给予药物溶剂

图6 肉桂油口服液(100mg/kg)逆转沙门菌感染小鼠体质量下降 1.健康对照组，小鼠无细菌感染；2.细菌感染组+肉桂油口服液，以1×106 CFU细菌/只攻菌量感染小鼠，同时给予100 mg/kg肉桂油口服液；3.细菌感染组，以1×106 CFU细菌/只攻菌量感染小鼠；4.细菌感染组+药物溶剂，以1×106 CFU细菌/只攻菌量感染小鼠，同时给予药物溶剂

图7 肉桂油口服液缓解沙门菌感染小鼠盲肠组织病理性损伤 1.健康对照组，小鼠无细菌感染；2.细菌感染组+肉桂油口服液，以1×106 CFU细菌/只攻菌量感染小鼠，同时给予100 mg/kg肉桂油口服液；3.细菌感染组，以1×106 CFU细菌/只攻菌量感染小鼠；4.细菌感染组+药物溶剂，以1×106 CFU细菌/只攻菌量感染小鼠，同时给予药物溶剂

3 讨论

传统的抗生素往往以细菌必需成分为药物靶标，容易引起细菌耐药性的产生[21]。目前，已有多篇文献报道抗沙门菌感染的抑制剂[22-24]，但多数原材料的不易获得，价格昂贵，药理机制不够清晰，限制了小分子抑制剂的应用。天然化合物能够有效规避原材料的难获取及价格高昂等不利因素。本试验结果表明，抗沙门菌感染的抑制剂肉桂油[25]能够以T3SS为药物靶标，通过抑制T3SS的功能达到抗沙门菌感染的作用，且不影响细菌生长，规避了细菌耐药性的产生。动物试验结果表明，肉桂油口服液能够显著的降低感染小鼠的死亡率，缓解沙门菌感染小鼠引起的体质量下降。病理学试验表明，肉桂油口服液显著缓解了沙门菌感染小鼠的盲肠组织病理性损伤并且抑制盲肠炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ)的释放。以上结果提示，肉桂油口服液是一种潜在的抗沙门菌感染抑制剂。

图8 肉桂油口服液降低沙门菌感染小鼠盲肠细胞因子含量

目前的研究表明抗生素的使用，对细菌的选择性压力较大，易诱导细菌耐药性的产生，以沙门菌生长非必需基因T3SS为药物靶标，对细菌选择压力小，不易诱导细菌耐药性的产生，可以减少或者部分替代抗生素的使用，增加细菌耐药性的周期，延长抗生素的使用周期。