叶螨AChE突变型的原核表达及活性测定

周王艳，韦显星，高 溯，杨 金，李 博，王晓琴，卜春亚**

(1.北京农学院 生物与资源环境学院/农业农村部华北都市农业重点实验室，北京农学院，北京 102206；2.北京林果业生态环境功能提升协同创新中心，北京 100206)

朱砂叶螨(Tetranychuscinnabarinus)，是一种多食性世界性害螨，因其宿主广泛，适应性强、繁殖迅速，严重危害农林经济作物[1]。螨害轻则植株生长不良，重则整植株死亡[2]。乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)是生物神经传导中的关键酶[3-5]。AChE是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的重要作用靶标[6-7]，这类农药与AChE活性中心部位不可逆地结合，抑制酶水解，使ACh大量积累，受持续性刺激，进而抽搐性死亡[8]，但该类农药常难降解且靶向性差，对非靶标有益生物存在威胁。

不同生物间AChE较保守，但存在一定差异。比较不同物种AChE差异，以此构建AChE突变型，为研制和筛选选择性强的新型杀螨剂提供依据，这在虫害防治中具重大意义[9]。2016年，Wang等[10]对家蚕AChE进行定点突变构建原核表达载体，进一步研究了突变与农药抗性和特异性之间的关联。2015年韩晶玉等[11]对朱砂叶螨AChE进行同源结构建模，通过对比该螨AChE与人AChE功能位点以及周围区域氨基酸序列和空间结构的差异性，找出了4个差异位点E316W，W156Y，V105Y，H369G，初步推断这4个位点可能是螨AChE特有作用位点。本研究以此为理论依据，将朱砂叶螨AChE三点突变型V105Y/W156Y/E316W和W156Y/E316W/H369G，即位点VWE和WEH，插入pET-30a载体上进行体外表达，并纯化AChE突变型蛋白，并与野生型蛋白活性进行差异分析，可为筛选新型选择性杀螨剂提供试验指向。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

菌株与载体：Trans1-T1、E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)感受态细胞和pEasy-T1克隆载体均购自北京全式金生物有限公司，pET-30a载体为农业农村部华北都市农业重点实验室保存。

主要试剂：Primer STAR、EcoR I、XhoI购自Takara公司；TIANpure Mini Plasmid Kit购自天根生化科技(北京)有限公司；T4 DNA Ligase购自北京全式金生物有限公司；Protease Inhibitor Cocktail、eECL试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 目的基因扩增 以农业农村部华北都市农业重点实验室保存的朱砂叶螨去疏水区的AChE突变型pCold II/ace质粒为模板，设计带有EcoR I、XhoI位点的引物1ace-F：5’CCGCTCGAGAATGTTTTCTCCTCC3’和引物2 ace-R：5’CGCGAATTCCTAATTTGATGATCC 3’，PCR法扩增ace突变型基因，产物电泳分离鉴定，用试剂盒TIANgel Midi Purification Kit回收。

1.2.2 载体构建 将回收的ace片段连接T1载体转化，蓝白斑筛选阳性，经菌液PCR和双酶切验证无误，提取阳性质粒，进一步送测序鉴定。取测序正确的T1-ace质粒和pET-30a载体分别用EcoR I和XhoI双酶切，回收酶切产物。将其拼接后导入E.coliDH5α，进行验证，即完成pET-30a/ace突变型载体构建。将阳性质粒转化E.coliBL21(DE3)，进行PCR验证。

1.2.3 诱导表达 将1.2.2构建好的E.coliBL21(DE3)阳性菌株划线活化，挑取单菌落于3 mL含卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃，180 r/min活化培养3 h后，接入新LB培养基扩大培养，至对数生长期时加IPTG在37 ℃下诱导7 h后，收集菌体于-80 ℃保存。并进行SDS-PAGE鉴定，AChE突变型重组蛋白的大小约为66 kDa。

1.2.4 蛋白分离纯化 取收集的菌体，以20 mL磷酸盐缓冲液(pH 8.0)重悬后，加入20 μL 1U/μL DNase、200 μL 10 mg/mL 溶菌酶、200 μL Protease Inhibitor Cocktail(100×)和200 μL 10 mg/mL PMSF，于4 ℃混合预裂解1 h，再经超声破碎仪破碎至溶液呈清亮米黄色，4 ℃，7 800 r/min离心收集并取上清，加入已平衡的Ni-NTA柱料于4 ℃结合2 h，后分步洗脱，测OD280nm值，收集流出峰，进行SDS-PAGE鉴定。

1.2.5 AChE突变型重组蛋白的Western Blot鉴定 对获得蛋白的AChE特异性进行确认，将获得的蛋白电泳转移至PVDF膜上进行Western Blot验证。按照康为世纪一步法eECL试剂盒操作，以兔源抗AChE多克隆抗体作一抗，结合二抗孵育45 min后漂洗，再以eECL曝光显影。将鉴定正确的组分蛋白超滤浓缩，置换50 mM的Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液。按Thermo Scientific公司BCA试剂盒操作，绘制标准蛋白浓度曲线，测蛋白样品的蛋白浓度。

以野生型的酶活性为100%，换算突变型的活性。将得到的数据进行统计学分析，比对分析AChE野生型与突变型的酶活力差异显著性。

2 结果与分析

2.1 载体T1-ace突变型的构建

PCR扩增ace突变型基因，PCR产物电泳检测，产物大小与目的片段一致，将扩增片段分离进行胶回收。将回收的扩增片段连接到T1载体，转化Trans1-T1感受态细胞，蓝白斑筛选阳性菌株，提取质粒用EcoR I和XhoI进行双酶切验证，获得的2个片段的大小符合(图1)，将阳性质粒送测，测序正确，表明成功构建了T1-ace突变型。

注：M.DNA Marker III 1.T1-ace/VWE；2.T1-ace/WEH Note: M. DNA Marker III 1. T1-ace/VWE; 2. T1-ace/WEH图1 T1-ace 突变型质粒双酶切鉴定Fig.1 Double enzyme digestion identification of T1-ace mutants

2.2 pET-30a/ace突变型重组载体构建

取测序正确的T1-ace突变型质粒和pET-30a空载体，分别以EcoR I和XhoI进行双酶切后，胶回收双酶切产物。用T4连接酶将回收的目的基因与pET-30a载体拼接，导入DH5α感受态中，筛选阳性菌株，菌液PCR检测正确后，提取质粒进行双酶切鉴定，切割的片段大小为5 422 bp和1 782 bp(图2)，符合pET-30a载体与目的基因的大小，即重组载体连接成功。再将验证正确的质粒送测，进一步验证目的基因序列是否正确，结果表明测序正确，ace基因两突变型的突变点分别为W156Y/E316W/H369G和V105Y/W156Y/E316W同预期突变位点相符，即目的重组载体构建成功。

注：M.DNA Marker III; 1.pET-30a/ace/VWE 双酶切2.pET-30a/ace/WEH 双酶切 Note: M.DNA Marker III; 1. pET-30a/ace/VWE; 2. pET-30a/ace/WEH图2 pET-30a/ace 突变型(DH5α)质粒的双酶切Fig.2 Restriction enzyme analysis of pET-30a/ace mutants

2.3 目的蛋白的表达与纯化

将测序成功的质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，选择阳性菌株进行PCR检测，扩增出的片段与ace突变型基因大小一致，表明重组载体成功导入BL21(DE3)中，表达菌株构建完成。体外诱导表达的重组蛋白和Ni-NTA柱结合，梯度咪唑缓冲液洗脱纯化后，对流出峰样品进行SDS-PAGE鉴定(图3)。由泳道1～2可看出在诱导7 h后有一个大小约为66 kDa的蛋白大量表达；泳道3～5看出，收集的菌体破碎后上清中存在大量的该蛋白，即诱导表达的蛋白具有较好的水溶性。用梯度浓度咪唑进行洗脱，由泳道7～9知，在200 mM的咪唑洗脱液中有明显的目的条带，其大小在66 kDa左右同目的蛋白大小一致，即成功纯化出表达的重组蛋白。

注：a：AChE-VWE 重组蛋白；b：AChE-WEH 重组蛋白；M：蛋白 Marker；1：IPGT诱导0 h的全菌；2：IPTG诱导7 h的全菌；3：菌体破碎后离心的上清液；4：菌体破碎后离心的沉淀；5：结合Ni-NTA后的穿透液；6：40 mM咪唑洗脱的收集液； 7～9：200 mM咪唑洗脱的收集液Note:a. AChE-VWE recombinant protein; b. AChE-WEH recombinant protein; M. Protein Marker; 1. 0 h IPGT induction of whole bacteria; 2. 7 h IPTG induction of whole bacteria; 3. Supernatant, 4. Precipitate; 5. solutionnot binding with Ni-NTA; 6. 40 mM imidazole elution, 7-9. 200 mM imidazole elution图3 AChE突变型诱导表达纯化的SDS-PAGE鉴定Fig.3 SDS-PAGE identification of induced expression and purification of AChE recombinant protein

2.4 目的蛋白的Western Blot分析

对纯化的重组蛋白，进行Western Blot验证，发现在66 kDa处成功显影一条特异条带(图4)，说明表达出的蛋白具有AChE特异性。

注：M.蛋白maker；1.AChE-VWE重组蛋白；2.AChE-WEH 重组蛋白Note:M. protein maker; 1. AChE-VWE recombinant protein;2. AChE-WEH recombinant protein图4 重组蛋白的Western Blot结果Fig.4 Western Blot analysis of AChE recombinant protein

2.5 重组蛋白的活性分析

对纯化后的目的蛋白，以改良Ellman法测重组蛋白的活性，采用数理统计方法分析野生型与突变型的活性差异。发现与野生型相比，突变型的活性虽降低但差异不显著(图5)。说明AChE蛋白在VWE和WEH的位点突变后，仍然具有活性。

注：ace/1 782.朱砂叶螨AChE野生型；VWE、WEH.朱砂叶螨AChE突变型；a.代表差异性显著水平，标记字母相同表示相互间差异不显著Note:ace/1 782.Tetranychus cinnabarinus AChE wild type;VWE，WEH. Tetranychus cinnabarinus AChE mutant.a. represents the significant level of difference, and the same letter of the mark means that the difference between them is not significant图5 朱砂叶螨AChE野生型与突变型酶活力对比分析Fig.5 Comparative analysis of enzyme activities of Tetranychus cinnabarinus AChE wild type withthe mutants

3 讨 论

朱砂叶螨这类害螨，对杀螨剂易产生抗药性。乙酰胆碱酯酶是生物体重要的神经酶，对神经系统有十分重要作用，主要集中分布于虫体的头部与胸部[12]。AChE作为农药作用靶标，通过抑制AChE水解作用，导致ACh过多累积于突触，致使害螨因神经冲动、肌肉抽搐而死亡。

与传统杀螨剂相比，新型杀螨剂以不同种属AChE活性位点的差异来研发选择性强的杀螨剂，该杀螨剂选择性强，对害螨具较强毒性，减少对非靶标生物毒害性。现有机磷和氨基甲酸酯类农药作用位点，是靶标与非靶标生物共有的，在大面积使用过程中易对人畜等非靶标生物造成一定影响。并且有机磷农药经土壤、水等媒介，通过富集作用进入体内，并暴露、积累和残留在环境中，对生态环境系统造成破坏[13]。在近年的环境报道中，农药在杀死害虫的同时也会误杀非靶标昆虫——蜜蜂，一种高经济效益昆虫资源，在作物授粉保产增产中具重要意义，因此筛选出选择性强的杀螨剂是十分具有必要性的。

另一方面减缓螨的抗药性问题，随着杀虫剂长期滥用及过度依赖，导致昆虫产生抗药性[14-15]并可遗传[16]。据近年调查与组学数据检测结果表明[17]，随着有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的大量滥用，可导致害虫产生显著抗药性，AChE对杀虫剂的敏感下降，其根本原因为AChE基因发生突变[18]。2013年，王举梅对家蚕ace1进行三点突变，并得到突变前后对农药的敏感性有明显变化[19]；2018年，杨茜对家蝇抗药性与ace基因突变分析，检测得到突变频率较高位点[20]。突变对昆虫的抗药性有一定影响，但因突变位点不同，改变幅度大小有差异。生物之间的AChE比较保守[21]，以此相互对比。

为筛选出具新型高特异性的杀螨剂，可利用定点突变技术对螨特异性位点进行筛选，以此来鉴定杀螨剂特异性的差异。对比突变型VWE和WEH的蛋白活性发现二者活性都存在不同程度的降低，但没有达到显著水平，可能不同位点之间存在互补关系。

本研究成功构建pET-30a/ace表达载体，实现对AChE突变型原核高效表达系统构建，纯化得到较高纯度目的重组蛋白。通过测定AChE突变型活性，对比野生型有所降低但并无显著差异，结果表明这两种突变型未符合目的条件。但这为AChE功能和结构研究提供相应依据，同时为今后对于新型杀螨剂的筛选提供一定的创新性思路，也为后续大量深入研究奠定基础。