虾青素油对核桃油抗氧化性及货架期的影响

邢海亮，余旭亚，耿树香，宁德鲁，马 婷，韩本勇

(1.昆明理工大学 生命科学与技术学院,昆明 650500; 2.云南省林业和草原科学院，昆明 650204)

核桃(JuglansregiaL.)又名胡桃、羌桃，在我国品种繁多，种植面积及产量居于世界第一[1]。核桃油不饱和脂肪酸含量达90%以上，必需脂肪酸含量达75.8%[2]，具有预防心脑血管疾病、改善记忆力等多种保健功效[3]。由于核桃油不饱和脂肪酸含量较高，在加工、储藏过程极易发生氧化酸败，产生异味，影响核桃油的品质。因此，核桃油抗氧化是核桃油生产的一个核心问题。

添加二丁基羟基甲苯(BHT)、特丁基对苯二酚(TBHQ)等化学合成抗氧化剂是延长食用油货架期的常用手段。但是因化学合成抗氧化剂具有一定的危害性，许多国家对其添加量都有所限制[4]。所以寻找天然抗氧化剂来取代或减少化学合成抗氧化剂的使用量是食品抗氧化剂工业发展的趋势。对各种抗氧化剂的抗氧化活性研究及各抗氧化剂之间的协同作用是未来研究的一个重点[5]。

天然的虾青素油可以雨生红球藻为原料提取精制所得[6]。虾青素具有极强的抗氧化活性，其抗氧化能力为维生素E的500倍以上、辅酶Q10的800倍，具有清除自由基、中和活性氧等特性[7-9]。2010年雨生红球藻被我国卫生部门批准为新资源食品。虾青素的众多优势为利用虾青素油提高核桃油的抗氧化性及延长货架期提供了理论支持。

本文以添加了虾青素油的核桃油为研究对象，以过氧化值、酸价为指标，优化了虾青素油添加量，分析了虾青素油对核桃油理化指标、微量成分含量及脂肪酸组成的影响，对其氧化稳定性进行了初步探索，以期为核桃油天然抗氧化剂的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

核桃油，由云南省林业和草原科学院提供；虾青素油(虾青素含量10.2%)，购自AstaMAZ NZ有限公司。

硫代硫酸钠、三氯甲烷、冰醋酸、碘化钾、淀粉、无水乙醚、无水乙醇、氢氧化钾、重铬酸钾、硫酸等，分析纯；TBHQ，食品添加剂级；福林酚，生物试剂。

1.1.2 仪器与设备

FA2004N分析天平，上海箐海仪器有限公司；DS.85 10DTH超声波微波组合体系，上海生析超声仪器有限公司；HHw-D6水浴锅，金坛双捷实验仪器厂；Ultrospec 2100 pro紫外可见分光光度计，安玛西亚有限公司；5804R高速低温离心机，德国Eppendorf公司；Agilent 7890A系列气相色谱仪；Agilent 5975C系列质谱仪(MSD检测器)；岛津Ic-20at液相色谱仪，岛津实验器材有限公司；Agilent液相色谱柱(TC-C18，4.6 mm×250 mm)，安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 虾青素油添加量的优化

向核桃油中分别添加1.5%、2%、2.5%(以核桃油质量计)的虾青素油，采用超声方式进行混匀，超声频率为(40±1)kHz、功率为800 W、温度为(22±3)℃，保证混合均匀。将混匀的复合油分装至干净的玻璃瓶中，密封、避光存放于55℃烘箱中。定期测定油脂的过氧化值和酸价。

1.2.2 核桃油理化指标测定

过氧化值根据GB 5009.227—2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》测定；酸价根据GB 5009.229—2016《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》测定；碘值根据GB/T 5532—2008《动植物油脂 碘值的测定》测定；水分含量根据GB 5009.236—2016《食品安全国家标准 动植物油脂水分及挥发物的测定》中第二法电热干燥箱法测定；皂化值根据GB/T 5534—2008《动植物油脂 皂化值的测定》测定。

1.2.3 核桃油微量成分含量测定

维生素E含量根据GB 5009.82—2016《食品安全国家标准 食品中维生素A、D、E的测定》第一法反向高效液相色谱法测定。

多酚含量采用福林酚试剂，分光光度法测定[10]。

多酚标准曲线绘制：采用没食子酸溶液作为标准工作液，设置质量浓度梯度为10、20、30、40、50、60、70 μg/mL，用移液管分别移取没食子酸标准工作液1 mL于刻度试管中，加入0.5 mL福林酚试剂、2 mL 7.5%碳酸钠溶液和6.5 mL水，涡旋振荡1 min，70℃水浴反应30 min，冷却至室温后用10 mm比色皿在750 nm波长条件下测定吸光度，根据没食子酸标准工作液的吸光度(Y)和质量浓度(X)绘制标准曲线，得到标准曲线方程为Y=0.011 1X+0.036(R2=0.999 1)。

多酚含量测定：称取10 g油脂样品溶于50 mL正己烷中，用20 mL 60%的甲醇水溶液提取3次。合并提取液并真空干燥，残余物用微量甲醇溶解，用水定容至2 mL。用移液管分别移取水(空白)及样品待测液各1 mL于刻度试管中，加入0.5 mL福林酚试剂、2 mL 7.5%碳酸钠溶液和6.5 mL水，涡旋振荡1 min，70℃水浴反应30 min，冷却至室温后用10 mm比色皿在750 nm波长条件下测定吸光度。

1.2.4 核桃油脂肪酸组成分析

油脂脂肪酸组成采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)法测定[11]。取0.1 g油脂，加入2 mL 3%硫酸甲醇，70℃水浴甲酯化4 h，再加入2 mL正己烷，萃取4 h，取正己烷相进行GC-MS分析。

GC-MS条件：HP-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；载气为高纯氦气，流速1 mL/min；进样口温度250℃；不分流进样；柱温50℃保持5 min，以3℃/min的速度升至210℃保持3 min。质谱条件：EI离子源，电离能70 eV，离子源温度230℃。

1.2.5 核桃油货架期预测

采用Schaal烘箱法[12]，选取1.2.1最优虾青素油添加量，联合抗氧化剂0.02%TBHQ设立实验组与对照组。将样品于60℃烘箱中密封储存[13]，定期测定过氧化值和酸价。按照GB 2716—2018《食品安全国家标准 植物油》规定，油脂的过氧化值和酸价的最高限值，以及Arrhenius 经验公式对不同处理组的核桃油20℃货架期进行预测。

1.2.6 数据分析

全部实验均设置3组平行，利用ANOVA (SPSS19.0)一步法分析实验数据,P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与讨论

2.1 虾青素油添加量对核桃油过氧化值、酸价的影响

虾青素油添加量对核桃油过氧化值的影响如图1所示。

图1 虾青素油添加量对核桃油过氧化值的影响

由图1可知，随着储存时间的延长，不同处理组核桃油过氧化值均逐渐升高，不同添加量的虾青素油对核桃油的抗氧化效果不同。对照组(未添加虾青素油)的过氧化值变化最为明显，在储存2～3 d即超过了GB 2716—2018限值9.85 mmol/kg。添加虾青素油的核桃油过氧化值上升趋势有所减缓，其中添加了1.5%虾青素油的核桃油过氧化值在储存3～4 d超过9.85 mmol/kg；添加2%和2.5%虾青素油的核桃油在储存4 d左右达到9.85 mmol/kg。结果表明虾青素油对减缓核桃油过氧化值的增长有一定作用，所有实验组的抗氧化效果都优于对照组，其中添加2%和2.5%的虾青素油效果最为明显，且两组核桃油过氧化值之间无明显差异。

虾青素油添加量对核桃油酸价的影响如图2所示。

由图2可知，在核桃油过氧化值达到国标限值9.85 mmol/kg的过程中，所有处理组核桃油的酸价均在一定范围内有所增加，实验组核桃油的酸价增长速度略低于对照组，整体酸价上升幅度不大。酸价的增长主要与时间、水分及储存条件相关，时间越长，水分含量越大，储存温度越高，酸价增长速度越快[14]。本实验在过氧化值达到9.85 mmol/kg期间，由于储存条件相同，实验周期较短，各组中酸价(KOH)都远低于3 mg/g，但实验组与对照组相比，酸价增长趋势均有减缓。结果表明，虾青素油能减缓核桃油酸价的增长。

图2 虾青素油添加量对核桃油酸价的影响

本研究发现添加2%的虾青素油能显著减缓核桃油过氧化值的增长，且减少虾青素油添加量会削弱抗氧化效果，增加虾青素油添加量对抗氧化效果无明显增强。综合酸价结果，选择虾青素添加量2%进行后续研究。

2.2 虾青素油对核桃油理化指标、微量成分含量及脂肪酸组成的影响

虾青素油对核桃油理化指标及微量成分含量的影响见表1。

表1 虾青素油对核桃油理化指标及微量成分含量的影响

碘值、皂化值为食用油脂的两个重要参数，碘值反映油脂的不饱和程度，不饱和程度越小，对应的碘值越低，皂化值可反映油脂的平均相对分子质量。由表1可知，添加2%的虾青素油核桃油的皂化值及碘值均无明显变化。

水分对油脂的品质有一定的影响，水分是脂肪发生水解反应的媒介，油脂的水分含量过高，有利于微生物的滋生，产生大量酶，促进脂肪水解，增加游离脂肪酸的含量，从而导致酸败[15]。由表1可知，添加2%虾青素油与对照组相比，水分含量由0.34%降至0.19%。油脂中含有少量水分(0.2%)能减少亚油酸氢氧化物的分解，降低氧化活性，减缓氧化速率[16-17]，从而延长储存时间。

多酚和维生素E都具有良好的抗氧化活性。多酚是极好的电子供体，形成的酚类游离基稳定性强，不易氧化反应，是一种效果良好的抗氧化剂[18]；天然维生素E具有增强机体抗氧化能力和调节免疫系统等功能，是世界上使用最广泛的抗氧化剂之一[19]。由表1可知，添加2%虾青素油的核桃油维生素E和多酚含量分别为未添加的3.17、1.5倍，虾青素油中含有较为丰富的维生素E、多酚等天然抗氧化物质，这些天然抗氧化成分可直接增强油脂抗氧化能力，同时有利于虾青素的稳定[20]，从而进一步增强油脂的抗氧化能力。

虾青素油对核桃油脂肪酸组成的影响见表2。

表2 虾青素油对核桃油脂肪酸组成的影响 %

由表2可知，与添加前相比，整体上核桃油在添加2%虾青素油后脂肪酸组成及含量无明显变化。表明添加少量虾青素油对核桃油的脂肪酸组成无明显影响。

2.3 虾青素油对核桃油货架期的影响

按照GB 2716—2018《食品安全国家标准 植物油》规定，食用植物油过氧化值和酸价(KOH)的最高限值分别为9.85 mmol/kg和3 mg/g。油脂的货架期预测可根据高温加速氧化实验，采用外推法得到[21]。根据Arrhenius经验公式得知样品温度每降低10℃，储存时间延长约1倍[22]。添加不同抗氧化剂核桃油60℃下过氧化值和酸价的变化见图3。不同处理组核桃油货架期预测见表3。

图3 添加不同抗氧化剂核桃油60℃下过氧化值(A)和酸价(B)变化

表3 不同处理组核桃油货架期预测

由图3(A)和表3可知：60℃加速氧化条件下，未添加任何抗氧化剂的核桃油在2～3 d达到国标中过氧化值上限，相当于在20℃储存32～48 d；添加了2%虾青素油的核桃油在4 d左右达到上限，与未添加虾青素油相比，货架期在20℃延长了16 d以上。虾青素具有极强的抗氧化性，添加虾青素油后核桃油中的维生素E、多酚含量显著上升，这有效抑制了核桃油的氧化酸败，减缓了核桃油过氧化值的增长。效果最好的为添加2%虾青素油和 0.02% TBHQ的实验组，过氧化值在30 d达到上限，相当于20℃条件下储存480 d，而单独添加0.02%TBHQ的核桃油过氧化值于27 d达到国标上限，两者相比较可知核桃油在20℃的货架期延长了48 d。以上结果表明，虾青素油复合 TBHQ 可能存在协同作用，从而进一步增强了核桃油的抗氧化性。贺娜等[23]在研究3种抗氧化剂对核桃油稳定性的影响中发现，在云南核桃油中添加复合抗氧化剂时，其抗氧化效果远强于单独添加某单一抗氧化剂，其原因可能在于不同的抗氧化剂在发挥抗氧化效果时，二者相互作用，产生了新的酚类化合物，从而增强了核桃油的抗氧化性[24]。由图3(B)可知，在过氧化值达到9.85 mmol/kg的过程中，所有实验组酸价(KOH)均远小于3 mg/g，皆满足GB 2716—2018要求。结果显示，核桃油氧化速率要高于酸败速率。

3 结 论

添加2%虾青素油后，核桃油的各项理化指标均在国标设定范围内，天然抗氧化成分多酚和维生素E含量分别为未添加的1.5、3.17倍，水分含量由0.34%降至0.19%，脂肪酸组成无显著性变化，虾青素油联合0.02%TBHQ能大幅度延长核桃油的货架期，该条件下核桃油在20℃的货架期为480 d。

本研究结果表明核桃油中添加2%虾青素油可显著增强其抗氧化性，延长储存时间，同时2%虾青素油联合0.02%抗氧化剂TBHQ可为延长核桃油的货架期提供一种有效策略。