升清降浊胶囊含药血清对高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞增殖与凋亡影响的实验研究

谢彧轩，罗 昕，杨小双，杨 慧，童安荣

慢性肾衰竭(CRF)是指各种慢性肾脏病(CDK)引起的肾小球滤过率(GFR) 严重下降及与此相关的代谢紊乱和全身各系统受累为主要表现的临床综合征[1]。根据相关调查显示，在我国慢性肾小球肾炎(31.23%)、糖尿病肾病(20.79%)、高血压肾病(12.63%)是罹患CRF的前三位病因[2]。本次实验从糖尿病肾病入手，以高糖环境诱导肾小球系膜细胞增殖。糖尿病持续的细胞外高糖以及高糖介导的各种病理因素可以直接激活肾小球系膜细胞(MC)，活化的MC可发生明显的表型转变，出现增生、转分化、释放炎症介质，导致细胞外基质(ECM) 合成的增多和降解的减少，纤维连接蛋白(FN) 在系膜区的过度沉积等病理过程，进而形成恶性循环，使肾小球的损伤加剧，发生肾纤维化及肾小球硬化，最终导致了终末期肾衰竭(ESRD)[3-4]。此次实验是观察升清降浊胶囊含药血清的加入，对高糖环境下系膜细胞的生长状态有何影响，进一步研究该药物防治慢性肾衰竭的机制。

1 资料与方法

1.1 一般材料：选用大鼠肾小球系膜细胞为上海名劲生物科技有限公司出品，官网货号：CM-2055。SD大鼠40只，重量(220±20)g，购自宁夏医科大学实验动物中心。

1.2 主要试剂与药物：升清降浊胶囊购自宁夏回族自治区中医医院暨中医研究院；澳洲胎牛血清，DMEM高糖培养基购自美国invitrogen生命技术有限公司；青链霉素混合液购自北京索莱宝科技有限公司；CCK-8细胞增殖检测试剂盒和Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒均购自杭州联科技术股份有限公司。25 cm2透气盖培养瓶和6孔、96孔培养板购自美国corning公司。

1.3 主要仪器设备：单人单面净化工作台(中国苏州净化设备公司)；恒温CO2培养箱(美国Thermo公司)；倒置显微镜CKX3(日本奥林巴斯公司)；电热恒温水温箱(北京长源实验设备厂，HH.W21 600-C)；湘仪TDZ5-WS多管架自动平衡离心机(长沙湘仪公司)；高压灭菌锅(日本TOMY公司，TOMY-SX-300)。

1.4 实验方法

1.4.1 升清降浊胶囊含药血清的制备：将雄性SD大鼠40只，随机分为低糖空白血清组、高糖模型组、升清降浊胶囊高剂量组、升清降浊胶囊中剂量组、升清降浊胶囊低剂量组，每组8只。灌喂剂量的计算按人与大鼠间体表面积折算等效剂量。连续灌喂3 d，每天早晚各1次。第3天灌喂后1 h，无菌条件下腹主动脉取血，室温下放置4 h，将血液置于离心机中，以3 000 r/min离心15 min后取出；将血清吸出，置于56 ℃水浴箱中水浴30 min灭活抗体，然后在单人净化工作台上通过直径0.22 μm的滤器过滤除菌；无菌条件下装入离心管，放置-80 ℃冰箱备用。

1.4.2 细胞培养：将MC细胞株接种于完全培养基之中。完全培养基的成分为：10%胎牛血清，1%青链霉素以及89%的DMED培养基。用25 cm2的培养瓶盛放培养细胞，并将其置于37 ℃、二氧化碳浓度5%的培养箱中。观察细胞生长状态，在细胞生长良好，呈指数增长时方可进行实验。

1.4.3 实验分组与给药：实验分为5组，即低糖空白血清组，高糖模型组，升清降浊胶囊高、中、低剂量组。低糖空白组以大鼠空白血清加含糖量为10 mmol/L的DMEM培养基进行培养，高糖模型组用含糖量为30 mmol/L的DMEM培养基所配制的完全培养基培养。再分别向其他3组高糖完全培养基中加入10%的高、中、低3种浓度的升清降浊胶囊含药血清干预细胞。

1.4.4 药物对MC增殖抑制的检测：将完成分组的细胞悬液接种到96孔板中，每组6个复孔，每孔100 μl。将培养板放入37 ℃、5%浓度的CO2培养箱中，培养48 h。之后向每孔加入10 μl CCK-8溶液，再次将培养板放入培养箱中培养4 h。用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。细胞增殖抑制率=(1-药物组吸光度) /对照组孔吸光度×100%。

1.4.5 Annexin-VFIC/PI复染流式检测细胞凋亡率：将复苏后的细胞吹打成细胞悬液，再将细胞悬液均匀地接种在6孔板中，放入培养箱培养。次日细胞贴壁后将培养基换成上述含不同浓度升清降浊胶囊含药血清的培养基，以及低糖空白组、高糖模型组的培养基继续培养48 h。培养结束后在显微镜下观察细胞状态，细胞状态良好时，用含EDTA的胰蛋白酶消化吸收细胞。以1 000 r/min,离心5 min，吸去上清液，将1×Buffer液加入无菌双蒸水稀释为5×Buffer液，每组加入200 μl吹打细胞。避光加入5 μl FITC和10 μl PI，避光放置15 min，经300目尼龙网过滤后上机检测。

2 结果

2.1 升清降浊胶囊对系膜细胞增殖的抑制作用：高糖模型组的OD值及抑制率远小于低糖空白血清组，提示高糖环境可显著刺激细胞增殖。低糖空白血清组同升清降浊胶囊高剂量组相比较，差异无统计学意义(P>0.05)；而升清降浊胶囊中剂量和高剂量与低糖空白组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。说明高糖环境可诱导系膜细胞增殖，而升清降浊胶囊对系膜细胞增殖的抑制效果随浓度的升高而升高,见表1。

表1 处理48 h后大鼠肾小球系膜细胞增殖情况

2.2 升清降浊胶囊诱导系膜细胞凋亡的效果：在流式细胞散点图上(图1-图4，目录后)，第一象限、第二象限、第三象限、第四象限，分别表示活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞、坏死细胞。细胞总凋亡率为细胞早期凋亡率与晚期凋亡率之和。结果表明，低糖空白组与高糖模型组相比差异无统计学意义(P>0.05)，但是低糖空白组的凋亡趋势更明显一些。加入升清降浊胶囊含药血清后，细胞的凋亡率相比高糖模型组差异有统计学意义(P<0.05)，说明该药物的加入有助于诱导细胞凋亡,见表2。

表2 处理48 h 后大鼠肾小球系膜细胞凋亡情况

注：*与高糖模型组比较，P>0.05;#与高糖模型组比较，P<0.05。

3 讨论

肾小球系膜细胞是肾脏最重要的固有细胞之一，能够维持肾小球系膜区细胞外基质的代谢平衡[5]。根据相关资料显示，MC是肾小球内具有活跃功能的固有细胞，同时也是被深入研究的对象。MC能产生多种细胞因子与炎性介质，还能分泌基质降解酶物质，这些都会参与和加重肾小球病变及损伤。各种刺激均易引起其增生，是构成肾小球疾病的最主要病变原因。MC的过度增殖，一方面突入肾小球毛细血管腔，导致管腔狭窄或闭塞；另一方面又会造成ECM的大量产生和聚集[6]。ECM在肾小球内的大量堆积，又是导致肾小球硬化和功能损害的主要机制。而肾小球硬化是各种慢性肾脏疾病进入慢性肾功能衰竭的共同途径[7]。因此，倘若能有效抑制MC的过度增殖，阻止ECM的产生和聚集，则可以有效减轻肾小球功能的损伤，阻止肾小球硬化的发展，进一步保护肾功能，及早防止慢性肾衰的发生和发展。

传统中医典籍中没有“慢性肾衰竭”这一病名的记载，但是根据该病的临床表现可将其归入祖国医学的“水肿”“关格”等范畴。为了更好地防治CRF，导师童安荣主任医师自拟了“升清降浊胶囊”，其组方为：柴胡，黄芩，党参，黄芪，枳壳，生地，山茱萸，山药，茯苓，葛根，远志，石菖蒲，丹参，当归，蝉蜕，僵蚕，大黄。查阅相关资料可知[8-9]，该方中多数药物经过大量的实验研究已经证实可有效抑MC的过度增殖。根据本次实验结果，升清降浊胶囊含药血清可有效抑制MC增殖，并诱导其凋亡，且药物浓度越高则效果越突出。由此可知，升清降浊胶囊抑制MC增殖，阻止ECM的产生和沉积，是防止肾小球硬化，防止慢性肾衰发生发展、保护肾功能的重要环节。