涡旋辅助分散液液微萃取-气相色谱法测定清香型白酒中5种高级醇

范三红，李颖星，白宝清

（1.山西大学生命科学学院，山西 太原 030006；2.山西大学特色植物资源研究与利用山西重点实验室，山西 太原 030006）

清香型白酒独特的固态多微酿造及固态蒸馏工艺赋予了其丰富的呈香呈味物质和生物活性成分[1-2]。高级醇[3]是白酒中重要的呈香物质，主要由酿酒酵母在酿造的主发酵时间段生成，它能够增加白酒的协调感和饱满感，赋予白酒特殊的香气，给人愉悦的感觉，若浓度过高，则有令人不快的杂异味，并且饮用后容易“上头”，危害人体的健康[4]。正丙醇、2-甲基-1-丙醇（异丁醇）、3-甲基-1-丁醇（异戊醇）和β-苯乙醇占白酒高级醇总量的70%～80%[5]。

一般测定酒类中挥发性香气成分的方法是基于气相色谱质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）来实现[6-8]。孙啸涛等[1]采用涡旋辅助液液微萃取结合气相色谱-质谱法对67种白酒中四甲基吡嗪等物质进行了检测；吴继源[8]采用气相色谱内标法测定白酒中乙酸乙酯含量；赵东瑞等[9-10]应用固相微萃取法、液液萃取法结合气相色谱-质谱联用分析手段对芝麻香型白酒中含硫化合物进行定性分析。

目前关于白酒中高级醇的文献较少，由于白酒中的高级醇的含量很低，因此在色谱测定之前需要对其进行萃取和浓缩处理[10-13]。张倩等[14]应用液液萃取法结合气相色谱-质谱-嗅闻联用仪分析2种芝麻香型白酒中香气活性成分；倪伟等[6]采用分散液液微萃取和气质联用的方法检测了几种市售葡萄酒中的主要高级醇；李建民等[15]采用气相色谱-质谱联用研究酒醅中该酵母麸曲的不同添加比例对陶融型原酒中高级醇含量的影响；张雪雪等[16]采用气相色谱内标法对二锅头等酒中甲醇、正丙醇、异丁醇、异戊醇等物质进行了定量；唐晖慧等[17]采用分散液液微萃取结合气相色谱-火焰光度检测器法测定芝麻香型白酒中3-甲硫基丙醇的含量。

本实验建立了涡旋辅助分散液液微萃取-气相色谱法（dispersive liquid-liquid microextraction-gas chromatography，DLLME-GC）测定清香型白酒中高级醇的方法，对白酒样中分散液液微萃取条件进行了优化[18]，并测定其在6种不同酒精度清香型白酒中的含量，以期为研究清香型白酒提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

6种市售清香型白酒酒样（编号为Y-1、Y-2、Y-3、Y-4、Y-5、Y-6）：（酒精度分别为18%vol、42%vol、42%vol、53%vol、53%vol、53%vol）；正丙醇（纯度99.7%）、异丁醇（纯度99.0%）、异戊醇（纯度99.0%）、2,3-丁二醇（纯度98.0%）、β-苯乙醇（纯度99.0%）、乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯乙烯、三氯甲烷、四氯乙烯、二氯甲烷、溴苯（均为分析纯）：北京百灵威科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

GC-2010气相色谱仪：岛津企业管理（中国）有限公司；Vortex-6涡旋混合器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；AL204电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TG16A-W高速离心机：上海金鹏分析仪器有限公司；PB-10酸度计：北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 模拟酒样、标准溶液、标准工作液的配制

模拟酒样：准确移取900 μL正丙醇、异丁醇、异戊醇、2,3-丁二醇，200 μLβ-苯乙醇标准品溶液，用体积分数为15%的乙醇溶液定容至500 mL，配制模拟酒样。

标准溶液：准确移取100 μL正丙醇、异丁醇、异戊醇、2,3-丁二醇标准品溶液，20 μLβ-苯乙醇溶液于容量瓶中，分别用体积分数为15%的乙醇溶液定容至100 mL，使正丙醇、异丁醇、异戊醇、2,3-丁二醇体积分数为0.1%，β-苯乙醇体积分数为0.02%，4 ℃冰箱存储备用。

标准工作液：取适量标准溶液用体积分数为15%的乙醇溶液逐级稀释，得到正丙醇、异丁醇质量浓度为1.00～40.00 mg/L、异戊醇质量浓度为1.00～150.00 mg/L、2,3-丁二醇质量浓度为1.25～50.00 mg/L、β-苯乙醇质量浓度为0.25～10.00 mg/L的标准品溶液。

1.3.2 酒样前处理

将100 μL分散剂、60 μL萃取剂置于1.5 mL离心管中混合均匀。用微量注射器将混合有机相快速注入1 100 μL置于1.5 mL离心管的模拟酒样中。旋涡振荡器振30 s，7 000 r/min离心4 min。将下层有机相吸出，进行气相色谱分析。

1.3.3 Plackett-Burman 试验

Plackett-Burman试验设计在单因素试验基础上，以正丙醇的测定峰面积（Y）为响应值，从萃取剂体积（X1）、分散剂体积（X2）、萃取时间（X3）、酒精度（X4）、NaCl质量浓度（X5）、pH值（X6）中筛选出影响分散液液微萃取效率显著的因素[20-21]。

1.3.4 响应面试验设计

根据Plackett-Burman 试验结果，选取萃取时间（A）、NaCl质量浓度（B）、分散剂体积（C）3个因素设计响应面试验，对萃取条件进行优化。

1.3.5 气相色谱条件

色谱柱：SGEAC-20毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为高纯度氮气（N2），流速1.10 mL/min；分流比10∶1，进样量1μL，尾吹气30mL/min，氢气40 mL/min，空气400 mL/min，进样口温度230 ℃，检测器温度230 ℃，升温程序为起始温度40 ℃，保持2 min；以5 ℃/min升温至230 ℃，保持3 min，总分析时间43 min。

2 结果与分析

2.1 分散液液微萃取条件优化

2.1.1 酒样酒精度的选择

由于试验中萃取剂的用量比较少，市售白酒酒样的酒精度普遍较高，导致萃取溶剂在酒样中有一定溶解，并且随酒精度的增加溶解量也明显增加，当酒精度＞50%vol时，萃取剂与酒样完全互溶。考察酒精度分别为5%vol、10%vol、15%vol、20%vol对分散液液微萃取效果的影响，结果见图1。

图1 不同酒精度对分散液液微萃取效率的影响Fig.1 Effect of different alcohol contents on efficiency of dispersion liquid-liquid microextraction

由图1可知，正丙醇的萃取效率在各个酒精度下没有明显变化；当酒精度在5%vol～15%vol时，异丁醇、异戊醇和β-苯乙醇萃取效率明显增加；当酒精度在15%vol～20%vol时，β-苯乙醇萃取效率显著降低，异丁醇和异戊醇的萃取效率也有所下降；2,3-丁二醇萃取效率远小于其余的醇类；当酒精度增加至20%vol时，2,3-丁二醇萃取效率无明显提高。因此，选择酒样的酒精度为15%vol。

2.1.2 酒样pH值的选择

考察pH值分别3.5、4.5、5.5、6.5、7.5对分散液液微萃取效率的影响，结果见图2。

图2 不同pH值对分散液液微萃取效率的影响Fig.2 Effect of different pH values on efficiency of dispersion liquid-liquid microextraction

由图2可知，当pH值为3.5时，正丙醇、2,3-丁二醇、β-苯乙醇的萃取效果较差，异丁醇和异戊醇有一定的富集效果；当pH值在3.5～5.5时，正丙醇、异丁醇、异戊醇、β-苯乙醇的萃取效率有显著增加；当pH值在5.5～7.5时，异丁醇、异戊醇萃取效率显著减少，正丙醇和β-苯乙醇的萃取效率也有所下降，2,3-丁二醇无明显变化。因此，选择酒样的pH值为5.5。

2.1.3 萃取剂的选择

萃取溶剂在萃取过程中有非常重要的作用，直接影响着对目标物的萃取效率[5]。分别考察二氯甲烷、三氯乙烯、四氯乙烯、溴苯和三氯甲烷对分散液液微萃取效果的影响，结果见图3。

图3 不同萃取剂对分散液液微萃取效率的影响Fig.3 Effect of different extractants on efficiency of dispersion liquid-liquid microextraction

由图3可知，四氯乙烯和溴苯对5种高级醇的萃取效果都比较差，二氯甲烷作为萃取剂对5种高级醇的萃取效率均最高。因此，选择二氯甲烷为萃取溶剂。

2.1.4 萃取剂体积的选择

考察二氯甲烷体积分别为40 μL、50 μL、60 μL、70 μL、80 μL、90 μL对分散液液微萃取效率的影响，结果见图4。

图4 不同萃取剂体积对分散液液微萃取效率的影响Fig.4 Effect of different extractant volumes on efficiency of dispersion liquid-liquid microextraction

由图4可知，当二氯甲烷体积为40～50 μL时，5种高级醇萃取率都很低；当二氯甲烷体积为60 μL时，正丙醇、异戊醇、β-苯乙醇萃取效率显著增加，异丁醇和2,3-丁二醇的萃取率也有所增加；当二氯甲烷体积＞60 μL时，5种高级醇萃取效率都明显变小。因此，选择萃取剂体积为60 μL。

2.1.5 分散剂的选择

合适的分散剂有助于目标化合物的萃取和浓缩。考察分散剂乙腈、丙酮、乙酸乙酯、甲醇对分散液液微萃取效率的影响，结果见图5。

图5 不同分散剂对分散液液微萃取效率的影响Fig.5 Effect of different dispersants on efficiency of dispersion liquid-liquid microextraction

由图5可知，综合5种醇的萃取情况，丙酮作为分散剂的萃取效率更好。因此，选择丙酮作为分散剂。

2.1.6 分散剂体积的选择

考察分散剂体积分别为40 μL、60 μL、80 μL、100 μL、120 μL对分散液液微萃取效率的影响，结果见图6。

图6 不同分散剂体积对分散液液微萃取效率的影响Fig.6 Effect of different dispersant volumes on efficiency of dispersion liquid-liquid microextraction

由图6可知，当分散溶剂体积在40～100 μL时，正丙醇、异丁醇、异戊醇、β-苯乙醇的萃取效率显著增加；当分散剂体积＞100 μL时，异丁醇、异戊醇、β-苯乙醇的萃取效率降低，正丙醇萃取效果无明显变化，2,3-丁二醇萃取情况无明显差异。因此，分散剂体积选择100 μL。

2.1.7 NaCl质量浓度的选择

盐的加入可以改变水溶液的离子强度和溶质的溶解度，考察NaCl溶液质量浓度分别为0、0.04 g/mL、0.07 g/mL、0.10 g/mL、0.13 g/mL、0.16 g/mL、0.19 g/mL对分散液液微萃取效率的影响，结果见图7。

图7 不同NaCl质量浓度对分散液液微萃取效率的影响Fig.7 Effect of different NaCl mass concentrations on efficiency of dispersion liquid-liquid microextraction

由图7可知，5种高级醇的萃取效率在质量浓度为0.19 g/mL时最高。当质量浓度为0.21 g/mL时离心管底部有NaCl固体不溶物，溶液达到饱和。因此，盐浓度选择0.19g/mL。

2.1.8 萃取时间的选择

考察萃取时间分别为10 s、20 s、30 s、40 s、50 s对分散液液微萃取效率的影响，结果见图8。

由图8可知，异戊醇和β-苯乙醇在萃取时间为30 s时萃取效果最好；异丁醇在萃取时间为20 s时萃取效率最高，但与萃取时间为30 s时萃取效果没有显著差异；当萃取时间＞30 s时，正丙醇、2,3-丁二醇萃取效率没有显著变化。因此，萃取时间选择30 s。

图8 不同萃取时间对分散液液微萃取效率的影响Fig.8 Effects of different extraction time on efficiency of dispersion liquid-liquid microextraction

2.2 Plackett-Burman试验结果及分析

在单因素试验的基础上，以正丙醇的峰面积（Y）为响应值进行Plackett-Burman试验设计，每个因素设计了高（1）、低（-1）2个水平，对萃取剂体积（X1）、分散剂体积（X2）、萃取时间（X3）、酒精度（X4）、NaCl质量浓度（X5）、pH值（X6）进行显著性考察。随机选择正丙醇为例以阐明其过程和结果分析，结果见表1，Plackett-Burman试验各因素主效应分析见表2。

表1 Plackett-Burman试验设计及结果Table 1 Design and results of Plackett-Burman experiments

由表2可知，萃取剂体积、萃取时间两个因素影响显著（P＜0.05），NaCl质量浓度因素P=0.077 4，影响也较大，因此确定出对分散液液微萃取效果影响最显著的因素为萃取剂体积、萃取时间和NaCl质量浓度，选取这3个因素进行响应面优化。分散剂体积、酒精度和pH值选取单因素试验最优水平，即分散剂体积100 μL、酒精度15%vol、pH值5.5。

表2 Plackett-Burman试验各因素效应分析Table 2 Main effects analysis of each factors of Plackett-Burman experiments

2.3 响应面试验结果及分析

根据Plackett-Burman试验结果，选取萃取剂体积（A）、NaCl质量浓度（B）和萃取时间（C）为自变量，正丙醇的测定峰面积（Y）为响应值进行Box-Behnken试验。利用Design-Expert 8.0.6 软件设计试验，设计方案及结果见表3，方差分析结果见表4。正丙醇基于响应值与变量绘制的二次回归模型如下[19-20]：

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface experiments

使用相同的方法，根据响应值与变量的关系，绘制其余四种高级醇的二次回归模型如下：

表4 回归模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4可知，模型的P值＜0.001，表明试验误差很小，模型具有较高的统计学意义，适用于数据分析；失拟项P值=0.530 4＞0.05，没有统计学意义，表明试验误差对模型没有显着影响。回归方程总决定系数R2=0.9980，表明该模型对实验拟合度较好，可用该模型对实验结果进行预测。方差分析的结果也显示了一次项A、B和C，交互项AB和BC以及二次项A2、B2和C2对结果影响极显著（P＜0.01）。回归模型可以反映正丙醇的测定峰面积与萃取剂体积，NaCl质量浓度和萃取时间之间的关系。

由Design Expert 8.0.6软件绘制各因素交互作用的响应面及等高线，结果见图9。由图9可知，萃取剂体积50～70 μL、NaCl质量浓度0.18～0.20 g/mL范围内，萃取率先增大后减小；萃取剂体积50～70 μL、萃取时间20～40 min范围内，分散液液微萃取率先增大后减小；NaCl质量浓度0.18～0.20 g/mL、萃取时间20～40 min时，分散液液微萃取率先增大后减小。通过对回归模型的分析，可以确定分散液液微萃取的最佳条件为萃取剂二氯甲烷60 μL、NaCl质量浓度0.19 g/mL、萃取时间30 s。在此最佳萃取条件下，正丙醇的测定峰面积为7.399×108。

图9 各因素对分散液液萃取效率影响的响应面及等高线Fig.9 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on efficiency of dispersion liquid-liquid microextraction

2.4 清香型白酒中高级醇检测方法验证

2.4.1 检出限、定量限和标准曲线的考察结果

清香型白酒中5种高级醇线性范围、标准曲线回归方程方程、线性相关系数（R2）、检测限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quantitation，LOQ）。线性相关系数（R2）在线性范围内都＞0.99，线性关系良好。将信噪比＞3确定为检出限，信噪比＞10确定为定量限；检出限（LOD）范围为0.01～0.03 mg/L，定量限（LOQ）范围为0.05～0.10 mg/L。

表5 5种高级醇的线性方程、线性范围、相关系数、检出限和定量限Table 5 Linear regression equations,linear ranges,coefficients,detection limit and quantitation limit of 5 higher alcohols

2.4.2 精密度及加标回收率试验结果

以市售清香型白酒Y-1为加标样品，用蒸馏水稀释至酒精度为15%vol。依照上述确定的最佳萃取条件，用模拟酒分别制备10 mg/L、30 mg/L、60 mg/L的正丙醇、异丁醇、异戊醇、2,3-丁二醇、β-苯乙醇混合标准溶液，按照酒样前处理方法处理，连续进样3 d，每个浓度进样5针，计算回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）（n=5），结果见表6。由表6可知，日内、日间精密度结果的RSD分别＜7%、＜8%，表明该检测方法精密度良好。加标回收率在83.1%～108.3%之间，表明该方法准确度高。

表6 方法的精密度及加标回收率试验结果Table 6 Results of precision and standard recovery rate tests of method

续表

2.5 实际酒样检测结果分析

对从市场购买的6种不同品牌的清香型白酒（用蒸馏水稀释至酒精度为15%vol中正丙醇、异丁醇、异戊醇、2,3-丁二醇和β-苯乙醇的含量进行检测。6种白酒的正丙醇、异丁醇、异戊醇、2,3-丁二醇和β-苯乙醇的含量分别为0.064～0.116 g/L、0.057～0.127 g/L、0.262～0.450 g/L、0.017～0.035 g/L和0.008～0.012 g/L。

表7 6种清香型白酒中5种高级醇含量的检测结果Table 7 Determination results of 5 higher alcohols contents in 6 light-flavor Baijiu samples

3 结论

本实验建立了一种基于DLLME与GC联用分析清香型白酒中主要高级醇的新型分析方法。结果表明，6种白酒中的正丙醇和异丁醇在质量浓度为1.00～40.00 mg/L、异戊醇在质量浓度为1.00～150.00 mg/L、2,3-丁二醇在质量浓度为1.25～50.00 mg/L和β-苯乙醇在质量浓度为0.25～10.00 mg/L的范围内具有较好的线性关系（R2＞0.99）；检出限为0.01～0.03 mg/L，定量限为0.05～0.10 mg/L。日内、日间精密度结果的RSD分别＜7%、＜8%，表明该检测方法精密度良好；加标回收率在83.1%～108.3%之间，表明该方法准确度高。

对6种白酒分析表明，所有酒样中均含有5种高级醇，正丙醇含量范围为0.064～0.116 g/L，异丁醇含量范围为0.057～0.127 g/L，异戊醇含量范围为0.262～0.450 g/L，2,3-丁二醇含量范围为0.017～0.035 g/L、β-苯乙醇含量范围为0.008～0.012 g/L。该方法具有快速、简便、低成本和环保等优点，能够满足实践中生产工艺的控制和成品质量检验等实验的需要。