MicroRNA-182和microRNA-152在早期子宫内膜癌组织中的差异性表达

曹双双 陈世超 解丹 梁义娟

子宫内膜癌是女性生殖系统最常见的肿瘤之一[1]，是发生于子宫内膜的上皮源性恶性肿瘤，近年来其发病率呈上升趋势，且发病年龄也逐渐呈现年轻化。有研究表明，某些microRNA(miRNA)与子宫内膜癌的发生发展具有一定相关性。如研究发现miRNA-139-5p在子宫内膜癌中的表达下调，过表达的miRNA-139-5p通过靶向基因HOXA10抑制子宫内膜癌细胞的生长和迁移能力[2]。还有研究发现miRNA-34a，miRNA-424和miRNA-513直接调控基因MMSET来削弱子宫内膜癌细胞的侵袭和球形形成能力进而抑制子宫内膜癌的发生和疾病进展过程，并证明miRNA-34a，miRNA-424和miRNA-513的表达降低与子宫内膜癌患者的预后较差密切相关[3]。本研究通过检测miRNA-182 和miRNA-152在早期子宫内膜癌组织中的表达情况，探究二者在子宫内膜癌进展过程中扮演的角色，以期对其早期筛查、诊断和临床治疗提供新方向，为实现子宫内膜癌的分子靶向治疗奠定基础。

对象与方法

1.研究对象：选取2018年3月至2018年8月在河北大学附属医院进行手术治疗的早期子宫内膜癌患者和因子宫肌瘤行全子宫切除术的患者各40例。纳入标准：(1)所有患者均由本院首次诊治；(2)早期子宫内膜癌患者均经病理确诊；(3)子宫肌瘤患者均经病理除外子宫内膜病变；(4)术前未经放疗、化疗、激素及生物治疗；(5)患者无严重肝肾功能损害或多器官功能损害，无自身免疫性疾病及血液系统疾病，未合并其他类型恶性肿瘤，并能耐受手术者；(6)所有患者均有本院明确的病理结果；(7)临床资料完整，术中收集组织标本；(8)经告知同意，并愿意配合、签署知情同意书。

2.方法：分别于术中切取子宫内膜癌肿瘤组织和正常子宫内膜组织。所有组织均在子宫离体30分钟内切取并迅速放入液氮中，立即转移至实验室-80℃冰箱中储存备用。所有实验组标本均经本院病理科同一医师术后病理结果确诊为早期子宫内膜癌，对照组术后病理提示子宫肌瘤，并均除外子宫内膜病变。

3.实时聚合酶链反应(real-time PCR)：用Lysis/Binding buffer试剂盒(Invitrogen公司)提取早期子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织的总RNA，每一步均严格参照说明书的详细步骤进行。酶标仪测定所提取的总RNA的浓度以及纯度，并使用移液枪取1ug·ml-1RNA，进行加尾及逆转录反应合成cDNA。利用miDETECT A TrackTM miRNA qRT-PCR Kit试剂盒(With ROXI)(广州锐博生物科技有限公司)以cDNA作为模板，使用miRNA-182、miRNA-152和对照S5引物配制PCR反应体系:2×qPCR Mix 17.5 μl；2.0 μmol·L-1引物0.5 μl； cDNA 2.0 μl；轻轻混匀后离心，放入荧光定量PCR仪(Life Technologies公司的7300 Real-Time PCR System)中。设置反应条件为:95℃ 预变性10 min; 95℃ 变性2 s，60℃ 30 s退火/延伸，循环40次；最后运行溶解曲线程序。miRNA-152和miRNA-182所有引物及内参S5均由广州锐博生物科技有限公司合成。数据采用2-ΔΔCT进行分析，其中，ΔCT = CT目的基因-CT对照基因；ΔΔCT=ΔCT实验样本-ΔCT对照样本。

结果

1.研究对象一般特征

研究对象为2018年3月—2018年8月河北省保定市及周边地区的经病理确诊的早期子宫内膜癌患者，年龄49～58岁，平均(52.5±2.18)岁。经病理除外子宫内膜病变的子宫肌瘤患者，年龄49～55岁，平均(51.65±1.73)岁。两组患者年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.real-time PCR检测结果显示：

(1)miRNA-182在早期子宫内膜癌组织中和正常子宫内膜组织中的相对表达量分别为(1.5499±0.4808)和(0.7767±0.4072)，差异有统计学意义(P<0.05),见图1。

(2)miRNA-152在早期子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织的相对表达量分别为(0.5010±0.2363)和(0.9037±0.2304)，差异有统计学意义(P<0.05),见图2。

A:正常子宫内膜组织 B:早期子宫内膜癌组织图1 子宫内膜组织中miRNA-182相对表达情况

A:正常子宫内膜组织 B:早期子宫内膜癌组织图2 子宫内膜组织中miRNA-152相对表达情况

讨论

子宫内膜癌作为最常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，严重危害着广大女性的生命健康，其疾病的发展是一个累积遗传和表观遗传学改变的多步骤的过程。其发病率逐年升高，有统计数据表明子宫内膜癌发病率在北美及欧洲等发达国家排名第4[4]，在中国仅落后于宫颈癌居第2位。其居高不下的发病率及发病人群逐渐年轻化的特点还同时带来了一系列的社会问题，如许多年轻患者以及她们的家庭有强烈的生育愿望，那么传统的治疗手段即手术治疗对于这部分患者将不能作为首选治疗方案。因此探寻子宫内膜癌新的诊疗手段成为了当下亟需解决的问题。近年来，分子生物学领域的研究不断深入并取得了一定的进展，miRNA重要的生物学功能逐渐被研究和证实，miRNA与恶性肿瘤千丝万缕的联系也逐渐被认知和重视。miRNA是在进化过程中能够达到高度保守的非编码的微小RNA，其长度约为19～22个核苷酸，基因的表达包括转录、翻译及翻译后的加工这几个过程，而miRNA可实现转录水平后的基因表达的调控，因此相较于某些蛋白，它们更能够从根本上调控基因的表达，进而影响一系列的生命活动。miRNA的种子序列以碱基互补配对的方式结合其对应靶基因信使RNA(mRNA)的3′端非翻译区，干扰靶基因mRNA翻译过程的正常进行，甚至可以使靶基因mRNA降解，从而激活或沉默靶基因[5]。miRNA可以通过影响细胞增殖、细胞分化及细胞凋亡等生物学行为进而调控机体的各种生理功能，其表达异常现已证实与多种人类疾病相关，其与恶性肿瘤的演变过程关系密切[6-8]，这也已经成为学者们关注和研究的热点。miRNA-182和miRNA-152是近来较受关注的miRNA，研究证明与多种肿瘤关系密切。

miRNA-182定位于人7号染色体[9]。研究证实miRNA-182参与肝癌[10-11]、肺癌[12]、前列腺癌[13]、宫颈癌[14]、肾癌[15]等多种恶性肿瘤的疾病演变过程。miRNA-182在子宫内膜癌中的研究较少，有研究认为miRNA-182是子宫内膜癌的促癌基因。梁静等[16]的miRNA基因芯片筛选结果显示miRNA-182在子宫内膜样腺癌中表达明显上调。还有研究进一步发现，miRNA-182可干扰子宫内膜癌肿瘤细胞的凋亡过程，并同时可提高其增殖活性，并证明对子宫内膜癌肿瘤细胞的调控是通过靶向基因Foxo1实现的[17]。尽管已经有一定的研究基础，但这一结论还目前还缺乏大量的临床组织学验证。

miRNA-152是miRNA-148/152家族的成员之一，它位于人类的第17号染色体和小鼠的第11号染色体上[18]。miRNA-152目前已经被证实在许多种恶性肿瘤如肝癌[19]、乳腺癌[20]、结直肠癌[21]、宫颈癌[22]、卵巢癌[23]及膀胱癌[24]中充当抑癌因子，与肿瘤的发生、发展密切相关。近年来，逐渐开始有国内外的学者对miRNA-152与子宫内膜癌疾病发生和演变的相关性密切关注并展开研究。这些主要研究集中在细胞水平，证明了miRNA-152通过不同调控通路影响子宫内膜癌肿瘤细胞的生长、增殖及分化等生物学功能。如有研究认为，miRNA-152靶向基因WNT-1[25]和c-MET[26]调控子宫内膜肿瘤细胞增殖水平。还有学者认为miRNA-152-3p的表达受激素的调控，如孕酮可使miRNA-152-3p表达水平提高，进而降低子宫内膜癌上皮细胞的增殖活性，并进一步提出CDC14A可能是miRNA-152-3p的靶蛋白[27]。Tsuruta等[28]研究表明miRNA-152的抑癌作用与DNA高甲基化有关，miRNA-152靶向DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferasel,DNMT1)，miRNA-152的表达活性被DNA高甲基化抑制，进一步使子宫内膜癌细胞的增殖能力降低。还有学者在此基础上研究发现组蛋白乙酰化和DNA甲基化通过诱导miRNA-152高表达进一步抑制子宫内膜癌细胞的生长、增殖及分化等生物学行为，发挥其抑癌因子的作用[29]。我们的前期研究也发现miRNA-152可以使子宫内膜癌细胞的G2/M期阻滞，干扰其正常的细胞增殖进程，这一功能是通过靶向CDC25B实现的[30]。

在此基础之上，本课题在组织学水平开展研究，研究结果显示miRNA-182子宫内膜癌组织标本中的相对表达量明显高于正常内膜组，提示在子宫内膜癌的发生和疾病进展过程中扮演促癌因子的角色。miRNA-152在早期子宫内膜癌组织中的表达水平相较于对照组正常子宫内膜组织明显降低，证明了miRNA-152是子宫内膜癌的肿瘤抑癌因子，在子宫内膜癌发生和疾病进展过程中发挥不可或缺的关键作用。

子宫内膜癌发病原因至今并没有完全明确，发病率也存在着较为明显的种族差异和地域差异。目前普遍认为遗传、吸烟、肥胖、高血压、糖尿病及激素治疗等是其发病的高危因素，但其导致癌症发生和进展的具体分子机制未明。近来有国外学者研究证明增加适当的体育锻炼活动可以提高子宫内膜癌患者的生活质量[31]。本研究结果显示，在观察组早期子宫内膜癌组织中，相较于对照组子宫内膜组织miRNA-182和miRNA-152呈现出不同的表达水平，前者呈现高表达的状态，而后者则表达降低。推测子宫内膜癌的疾病发生和演变过程与miRNA-182和miRNA-152的表达失常有直接关系，二者可能通过某些或简单或复杂的调控通路对子宫内膜癌肿瘤细胞的生物学功能造成一定的影响，进而促进或抑制子宫内膜癌疾病的发生和演变过程。其有望成为子宫内膜癌筛查、诊断、判断预后以及治疗后随访的分子生物标志物，并为子宫内膜癌的分子靶向治疗提供理论基础。但目前二者的研究主要集中在分子水平，缺乏大量的临床组织学验证，且本研究时间较短、样本量较小，并仅仅取材于早期肿瘤组织，故其是否与子宫内膜癌的疾病进展、肿瘤分型、病理分级以及其他临床病理参数相关仍不清楚，是否影响子宫内膜癌患者的预后也并不能确定，需要我们进一步加大样本量继续深入研究和随访。