树莓果实中树莓酮含量变化及受茉莉酸甲酯调控影响分析

闫希焕，刘 芳，杨梅霞，黄体冉，杨明峰*，马兰青,3*

(1.北京农学院植物科学技术学院/农业农村部华北都市农业重点实验室，北京 102206；2.北京农学院生物与资源环境学院/农业农村部华北都市农业重点实验室，北京 102206；3.北京农学院生物与资源环境学院/北京林果业生态环境功能提升协同创新中心，北京 102206)

树莓(Rubusidaeus)，又称覆盆子、木莓和悬钩子等，是一种蔷薇科(Rosaceae)、蔷薇亚科(Rosiodeae)、悬钩子属(RubusL.)半灌木植物[1]，在中国古代树莓酮就有很高的食用与药用价值，树莓果实甘甜可口香气浓郁可强肾健脾，被记载在中国医学著作《本草纲目》中，在世界医学、保健、科研等领域都占有十分重要的地位[2]。现代医学研究已证明，树莓具有抗肿瘤、抗氧化、抗衰老，保护肝脏和降低血脂，降低血糖、抗菌消炎和止血凝血等作用，在各行各业被广泛应用[3]。树莓被列为第三代新兴水果，具有众多的药理和保健功能，在美国有“红宝石”“抗癌明星”的美称[4]。树莓根据果实成熟期不同分为夏果型树莓与秋果型树莓，夏果型树莓一般成熟在6月中旬，秋果型树莓果期较长，可从7月到10月持续结果。

树莓酮(Raspberry ketone)的分子式是C10H12O2，摩尔质量：164.204 G/mol，化学名为4-对羟基苯基-2-丁酮(4-(4-hydroxyphenyl)-2- butanone)。树莓酮在常温下呈现为白色针状结晶状态，不溶于水和石油醚，易溶于乙醇、乙醚、挥发性油等有机溶剂。树莓酮是树莓果实中一种具有代表性的功能化合物，在癌症、流感、心肌收缩、糖尿病和减肥等方面具有显著功效[5]，孟宪军等[6]将树莓酮应用于单纯肥胖性的大鼠，证明树莓酮可在大鼠体内调节糖脂代谢紊乱、改善瘦素抵抗和胰岛素抵抗等综合作用来降低大鼠的体质量。树莓酮也是合成莱克多巴胺的原始材料，莱克多巴胺作为一种强心药，大量应用于治疗充血性心力衰减症、肥胖症和肌肉萎缩等。除此之外，树莓酮还对增加胰岛ρ细胞中胰岛素的表达[7]、抑制胰腺损伤、促进小鼠毛发的生长及草酸钙的沉积具有显著作用[8]。值得特别关注的是，树莓酮还是树莓果实香气的主要特征化合物，是一种非常昂贵的天然香料，在美国售价已达到2万美元/kg。树莓酮香气清新甘甜、持续时间久并且可直接供人们食用，在欧美地区广泛用于高档甜品、冰激凌和化妆品定香剂。

茉莉酸甲酯作为植物体内重要的信息素物质，是目前应用最多的非生物诱导子，可通过诱导次生代谢产物合成关键酶的催化反应，在植株体上施加信号物质，从而促进植物防御基因的诱导表达，刺激次生代谢产物的生成和增加[9]。茉莉酸甲酯在20世纪60年代被Demole等[10]首次发现在茉莉属素馨花精油中。此后，茉莉酸甲酯作为重要的植物激素，广泛应用于果实品质的调控。孟书亦等[11]将茉莉酸甲酯(50 μmol/L)处理黄岑愈伤组织，其中黄岑苷的含量提高了1.8倍。李文渊等[12]用茉莉酸甲酯(100 μmol/L)处理丹参毛状根，根中苯丙氨酸解氨酶、4-香豆酰辅酶A连接酶基因大量表达，酚类代谢物迅速积累。茉莉酸甲酯(100 μmol/L)处理白及，检测到5个苯丙氨酸解氨酶的关键酶活性，在24 h之后高于对照组5倍[13]。对美乐酿酒葡萄叶面喷洒茉莉酸甲酯(10 mmol/L)，增加了20种花色苷物质的含量，并促进香豆酰化花色苷积累时间的提前[14]。Pedapudi等[15]对树莓细胞悬浮培养并用茉莉酸甲酯诱导，检测到诱导24 h后细胞悬浮物中的苯亚甲基丙酮和树莓酮含量增加了2～4倍。至今茉莉酸甲酯对新鲜的树莓果实有什么影响尚不清楚，树莓酮的提取方法也并不完善[16]。本试验利用新鲜的树莓果实，进行树莓酮提取、检测方法筛选，并在提取、检测方法的基础上进行4个树莓品种各果期果实树莓酮含量检测，发现树莓酮含量最高的果期，对其果实进行茉莉酸甲酯处理，探索茉莉酸甲酯对树莓酮含量的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

树莓果实材料均由中国林业科学研究院林业研究所董凤祥提供。品种为：托拉蜜(夏果型，红色果实，高香型)、伊瑞木(秋果型，红色果实，低香型)、波尔卡(秋果型，红色果实，低香型)、橙色传奇(秋果型，黄色果实，高香型)。

主要试剂：氯仿、甲醇、乙酸乙酯、石油醚、树莓酮标品(上海源叶生物有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 树莓果期的选择及样品处理 选择托拉蜜、伊瑞木、波尔卡、橙色传奇这4个品种的青果期果实(15 d)、半熟果期果实(27 d)、成熟果期果实(34 d)为供试材料。摘取果实，放入蒸馏水中浸泡1 min，将果实泥土污渍冲洗干净，用滤纸擦干、锡纸包好放入液氮中以供后续试验使用。

1.2.2 树莓酮提取方法的筛选 选用托拉蜜青果期果实(5 g)、成熟果期果实(5 g)为试验材料。分为A组、B组、C组、D组，使用30%甲醇、70%水对提取液进行高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)检测。A组45 ℃烘干青果期果实、成熟果期果实，氯仿抽提48 h，55 ℃旋蒸成粉末，溶于1 mL甲醇，过有机滤膜。B组液氮研磨青果期果实、成熟果期果实，氯仿抽提48 h，55 ℃旋蒸成粉末，溶于1 mL甲醇，过有机滤膜。C组液氮研磨青果期果实、成熟果期果实，氯仿抽提48 h，60 ℃溶解2 h，55 ℃旋蒸成粉末，溶于1 mL甲醇，过有机滤膜。D组液氮研磨青果期果实、成熟果期果实，氯仿抽提48 h，55 ℃旋蒸成粉末，乙酸乙酯溶解，加入石油醚萃取，4 ℃水除杂，55 ℃旋蒸成粉末，溶于1 mL甲醇，过有机滤膜。

1.2.3 HPLC方法优化 以树莓酮提取液为材料，使用Waters 1525高效液相色谱仪进行检测。色谱柱规格为柱长250 mm的Agilent ZORBAX SB-C18反向色谱柱，检测树莓酮过程中设置色谱柱柱温35 ℃，查看目标峰的吸光值波长为275 nm，流动相的流速设置成1 mL/min，流相为甲醇与水。样品组设为样品Ⅰ组、样品Ⅱ组、样品Ⅲ组、样品Ⅳ组、样品Ⅴ组。设置标品组为对照Ⅰ组、对照Ⅱ组、对照Ⅲ组、对照Ⅳ组、对照Ⅴ组。标品组每组HPLC程序分别对应样品组相同分组的HPLC程序。样品Ⅰ组：甲醇40%～25%(15 min)，水60%～75%(15 min)；甲醇25%～30%(20 min)，水75%～70%(20 min)；甲醇30%～40%(5 min)，水70%～60%(5 min)。样品Ⅱ组：甲醇0%～20%(15 min)，水100%～80%(15 min)；甲醇20%～30%(10 min)，水80%～70%(10 min)，甲醇30%～40%(5 min)，水70%～60%(5 min)；甲醇40%～0%(5 min)，水60%～100%(5 min)。样品Ⅲ组：甲醇20%～30%(15 min)，水80%～70%(15 min)；甲醇30%(20 min)，水70%(20 min)；甲醇30%～20%(5 min)，水70%～80%(5 min)。样品Ⅳ组：甲醇0%～30%(10 min)，水100%～70%(10 min)；甲醇30%(20 min)，水70%(20 min)；甲醇30%～0%(5 min)，水70%～100%(5 min)。样品Ⅴ组：甲醇0%～30%(10 min)，0.1%磷酸水100%～70%(10 min)；甲醇30%(20 min)，0.1%磷酸水70%(20 min)；甲醇30%～0%(5 min)，0.1%磷酸水70%～100%(5 min)。

1.2.4 树莓酮标准曲线的绘制 将树莓酮标品配成1 000.0、500.0、250.0、125.0、62.5 μg/mL，过0.22 μm有机滤膜，上样10 μL，选取Ⅳ组HPLC方法进行检测，数据经Excel表格进行分析绘制。

1.2.5 不同树莓品种果实中树莓酮含量检测 选用B组方法对托拉蜜、伊瑞木、波尔卡、橙色传奇4个品种的青果期果实、半熟果期果实、成熟果期果实中的树莓酮进行提取检测，每组3个生物学重复。

1.2.6 茉莉酸甲酯喷洒果实浓度和时间 配制茉莉酸甲酯溶液的浓度为0 μmol/L和100 μmol/L (0.1%吐温20)，分别喷洒托拉蜜、波尔卡、橙色传奇青果期果实15、30、90、180 min。将处理好的果实按照B组方法进行树莓酮提取，以及HPLC检测样品Ⅳ组方法进行样品中树莓酮含量的测定。

2 结果与分析

2.1 树莓果实三个果期

根据树莓果实生长规律，将树莓果实分为三个果期：青果期、半熟果期、成熟果期(图1)。

图1 树莓不同成熟期的果实Fig.1 Raspberry fruit at different maturity stages

2.2 树莓酮不同提取方法的结果对比

根据树莓酮的化学性质，确定4组提取方法，从而优化树莓酮提取效率，减少树莓酮提取过程中由于提取方法而产生的损失。对样品45 ℃烘干或60 ℃温育裂解，都会极大损失树莓酮含量，并且成熟果期果实中的树莓酮更易挥发。为保证树莓酮提取过程中杂质较少，用乙酸乙酯溶解、石油醚萃取除杂，但提取过程中多次溶解萃取造成树莓酮含量的减少。液氮研磨，氯仿抽提48 h树莓酮可检测到青果期果实树莓酮平均含量为7.78 μg/g，成熟果期果实树莓酮平均含量4.06 μg/g，目前方法中B组提取效果最好(表1)。

表1 不同提取试验方法对树莓果实树莓酮含量的影响Tab.1 Effect of different extraction methods on raspberry ketone

2.3 树莓酮高效液相色谱法的确立

树莓酮易溶于有机物质，不易溶于水，因为植物果实中含有大量酚类、酮类、脂类物质，所以需要建立一个完善的HPLC体系，在用时最短的情况下，使树莓酮能与其他杂质完全分离，出峰稳定，检测效率高。选取B组的提取液对树莓酮HPLC方法进行优化，其中样品Ⅰ组、样品Ⅱ组、样品Ⅴ组均未检测出目标峰，磷酸水不利于树莓酮出峰。样品Ⅲ组甲醇为20%时，峰型较小，杂质峰相对拥挤。样品Ⅳ组甲醇为0%～30%时，杂质峰出峰时间靠前，并且杂质峰集中在一块，与目标峰相离较远，树莓酮目标峰易于在甲醇为30%时出峰，并峰型较好，两边基线较平稳。样品Ⅳ组检测效果较好(图2)。

注：箭头指向为树莓酮样品峰Note: Arrow pointing to the raspberry ketone sample peak图2 树莓酮HPLC方法检测Fig.2 HPLC method for detection of raspberry ketone

2.4 HPLC检测5个浓度的树莓酮样品

树莓酮标准曲线图中纵坐标(y)代表5个不同浓度的树莓酮标品出峰面积，横坐标(x)代表树莓酮标品的5个浓度，加权计算线性回归方程，方程为y=3711.5x-11525，R2=0.9993(图3)。

图3 树莓酮标准曲线图Fig.3 The standard curve of raspberry ketone

2.5 4个树莓品种各果期树莓酮含量的检测

对托拉蜜、伊瑞木、波尔卡、橙色传奇各果期果实进行树莓酮含量检测，其中夏果型托拉蜜在半熟果期果实中树莓酮含量最高，青果期果实与成熟果期果实相差很小，伊瑞木、波尔卡与橙色传奇青果期果实树莓酮含量最高，其中黄树莓橙色传奇果实中树莓酮含量均高于红树莓果实，青果期果实树莓酮含量达到19.4 μg/g。橙色传奇青果期果实树莓酮含量最高(图4)。

图4 不同品种树莓果实树莓酮含量Fig.4 Raspberry ketone content of different varieties

2.6 茉莉酸甲酯(100 μmol/L)喷洒树莓果实树莓酮含量变化

托拉蜜、波尔卡、橙色传奇青果期果实经100μmol/L的茉莉酸甲酯(0.1%吐温20)处理15 min，树莓酮含量达到最大值。托拉蜜青果期果实经茉莉酸甲酯(100 μmol/L、0.1%吐温20)喷洒总体呈上升趋势，波尔卡、橙色传奇青果期果实在喷洒15 min后树莓酮含量开始下降，其中波尔卡青果期果实在喷洒30 min时树莓酮含量最低，大概降低了3倍(图5)。

图5 茉莉酸甲酯对树莓青果期果实树莓酮的影响Fig.5 Effect of methyl jasmonate on raspberry ketone in raspberry green fruit

3 讨 论

树莓酮是衡量树莓果实品质的一个重要风味物质，它被发现在19世纪20年代，后来人们证明它可以促进皮肤感觉神经元IGT-I的激活表达而增强皮肤弹性和头发再生[4]。树莓酮可平衡糖脂代谢、降低蛋白Atg12的表达，增加血红素加氧酶1(HO-1)的表达、瘦素抵抗和胰岛素抵抗来治疗中枢神经系统肥胖症，其功效好于奥利司他[17]。Badr等[18]发现在用乙醇诱导胃溃疡前服用树莓酮(50 mg/kg)，可减少80%的溃疡面积、由乙醇诱导的TBARs降低了66%，其功效等同于奥美拉唑。树莓酮在保护肝脏防止高血压、高血脂方面也有卓越的功效，例如：提升血清蛋白(APOA-I)含量和降低载脂蛋白B(ApoB)含量[19]。除此之外，树莓酮还可以抑制α葡萄糖苷的表达[20]、激活非酒精性脂肪肝中的Nrf2、降低脂质过氧化和炎症介质[21]。

茉莉酸甲酯是一种天然植物激素，常用于促进植物次生代谢。喷洒茉莉酸甲酯时黄岑中的查尔酮合酶活性达到最大值。查尔酮合酶与查尔酮异构酶是合成花青素的关键酶，催化4-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A形成二羟基黄烷酮，是花青素合成的关键步骤。同样4-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A在苯亚甲基丙酮合酶催化下生成树莓酮，两者产生底物竞争关系。

4 结 论

根据树莓酮化学性质，进行树莓酮提取化学方法和HPLC检测方法探索。可以发现树莓酮在高温下易挥发，乙酸乙酯和石油醚萃取造成树莓酮损失，树莓酮易溶于甲醇，不易溶于水，当增大甲醇体积时，则树莓酮出峰快，若样品中含有杂质，则应控制流动相中水与甲醇的体积比例，拉大出峰距离。

检测一个品种不同果期树莓酮的含量，得出夏果型树莓托拉蜜在半熟果期果实中树莓酮含量最高，其余三个秋果型品种在青果期果实树莓酮含量最大，黄树莓橙色传奇果实树莓酮含量平均高于其他品种3倍。喷洒100 μmol/L的茉莉酸甲酯(0.1%吐温20)在树莓青果期果实上，托拉蜜果实中树莓酮含量随喷洒时间增加，喷洒15 min时，树莓酮含量增加到最大值，波尔卡、橙色传奇青果期果实在15 min之后树莓酮含量开始减少。与未处理果实相比，树莓含量整体减少。探索出一套相对完整的树莓酮提取、HPLC检测方法，并且通过对树莓酮的检测可知，夏果型树莓果实树莓酮在半熟果期含量最高，秋果型树莓果实树莓酮在青果期含量最高，黄树莓果实树莓酮含量高于红树莓。