GC/MS检测慢性肾脏病患者血清与粪便中SCFAs含量

王浦，王斯琪，吕丹，陈烨

慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)已成为全球性的公共健康问题，影响着全世界多达10%人口的健康[1]。大量的研究显示，CKD的发生发展伴随着肠道菌群的失衡，导致肠道黏膜屏障损伤，细菌易位，尿素、吲哚、甲酚等大量的毒副产物进入循环系统，而受损的排泄功能进一步加重毒素的积累，从而影响疾病进程及导致并发症，如尿毒症脑病等发生[2-5]。由此，学者们提出了“肠-肾轴”概念，揭示了肠道微生态的改变与CKD之间的关系[6]。Ritz E[7]提出“肠肾综合征”再次表明CKD与肠道屏障改变之间密不可分的关系。

短链脂肪酸(short chain fattyacids，SCFAs)是指未被消化吸收的膳食纤维、蛋白和肽进入盲肠和结肠后，由微生物代谢产生的挥发性脂肪酸，由1～6个碳原子组成，主要包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸，其中乙、丙、丁酸占据了总量的95%[8-9]。正常情况下，人及动物体内菌群代谢产生的SCFAs，作为肠道上皮细胞的能量来源，对于维持肠上皮细胞形态与功能以及肠道黏膜屏障的完整性发挥重要作用。在CKD状态下，产SCFAs的菌群明显减少[2]。我们之前的研究证实，各期CKD患者中产丁酸的普拉梭菌和罗氏菌属较正常对照组均显著下降。因此，通过检测SCFAs的含量有可能可以反映CKD的疾病进展情况[10]。

目前，检测生物样品中SCFAs的方法有气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳(CE)以及原子吸收分光光度法[11-15]。但这些方法存在特异性差，灵敏度低，样本回收率不高以及处理过程繁琐等问题。气相色谱-质谱联用法(Gas chromatography-mass spectrometry，GC/MS)，即气-质联用，既弥补了GC只保留时间，难以对复杂化合物中未知组分做出可靠的定性鉴定的特点，又利用了鉴别能力强且灵敏度高的MS作为检测器，兼有色谱柱的高分离能力与质谱分析的强稳定性特点，操作简便，快速，便于准确获得样品中目标化合物的相关信息，分析过程快速且灵敏度高，有望应用于SCFAs的快速检测。本研究拟采用GC/MS快速检测CKD患者血清及粪便中SCFAs的含量，初步分析CKD患者与正常对照组SCFAs水平的差异，筛选差异指标，为其应用于监测肾衰进程及慢性肾脏病辅助诊断参考指标奠定基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象

研究对象为2016年3月至7月，72名在南方医院诊断为CKD5的患者，和同期来体检中心检查的健康自愿者，共61个正常对照者。排除标准：①四周内使用过抗生素，益生菌，益生元，合生元，尿及血清等含有导泻成分的制剂，②伴有腹泻，便秘，出血等肠道疾病的志愿者。所有入选的研究对象均已签署知情同意书接受本研究(No. 09 [2012])。

1.2 主要试剂及仪器

乙醚(分析纯)、乙酸乙酯(分析纯)、氯仿(分析纯)、100%硫酸(分析纯)、无水硫酸钠(分析纯)均购自Fisher scientific公司；乙酸、丙酸、丁酸标准品(纯度>99%)、甲醇(分析纯)均购自Sigma 公司；2-乙基丁酸标准品(纯度99%)购自德国默克公司；Thermo气相色谱质谱联用仪(Trace1310/ISO LT，含自动进样器)及DB-FFAP125-3232，30 m×0.25 mm×0.25 μm色谱柱购自安捷伦公司。

1.3 粪便标本的收集与处理

取正常对照者及CKD患者中段粪便约0.5 g(湿粪)于离心管中，加入5 mL超纯水制成粪液，13 000 rpm离心10 min后取1 mL上清液，滴加50 μL 2-乙基丁酸作为内标，混匀，静置20 min后，加入10 μL 50%硫酸、0.5 g无水硫酸钠进行酸化盐析，2 mL无水乙醚萃取，6 000 rpm离心5 min后，取上清液做GC/MS分析。

1.4 血清标本的收集与处理

取正常对照者及CKD患者外周静脉血上清液约50 μL，加入100 μL甲醇，13 000 rpm离心10 min后取100 μL上清，加入20 μL浓度为7.5 μg/mL的2-乙基丁酸作为内标，做GC/MS分析。

1.5 GC/MS分析具体方法

用氮气为载气，气流流速为1 mL/min。将柱温起始温度设置为80 ℃，保持1 min，然后，以10 ℃/min的速度将温度上升至170 ℃，保留0 min，后以20 ℃/min升温至200 ℃，维持2 min，分流比为5∶1，检测器温度控制为230 ℃，进样口温度设定为200 ℃，氢气、空气、氮气流速分别为30、300、20 mL/min，进样量为1 μL,每个标本分析时间为13.5 min。

1.6 SCFAs结果分析

将仪器自动分析获取的样本信息质谱图与标准质谱图数据库进行比较，将与数据库中乙酸、丙酸、丁酸标本峰对比后，进行标本定性分析(图1)。以2-乙基丁酸为内标，设定其丰度值为1，计算各标本中其他SCFAs与内标的相对丰度值。

1.7 统计方法

采用SPSS 20.0统计软件进行数据处理。结果用均数±标准差表示。服从正态分布资料选用t检验进行分析。非正态分布资料选用非参数Mann-WhitneyU秩和检验分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 正常对照组中SCFAs的分析

在正常对照者粪便与血清中，均检测出乙酸、丙酸、丁酸；其中，乙酸含量最高，丙酸次之，丁酸最少。正常对照组粪便中三种酸含量分别为(78.50±22.34)μmol/g，(26.35±11.48)μmol/g，(21.47±10.93)μmol/g，相对比值约为3.65∶1.23∶1，血清中三者的含量分别为(246.73±41.71)μmol/L，(24.87±3.91)μmol/L，(3.44±1.95)μmol/L，相对比值约为71.72∶7.23∶1，血清较粪便中三种酸比值差别大(图1)。

2.2 CKD患者中SCFAs的分析

CKD患者的粪便与血清中，也均检测出乙酸、丙酸、丁酸三种酸，其含量较正常对照组相比均降低；但与正常对照组相同的是，在CKD患者中无论粪便还是血清，乙酸均表现为高丰度，其次为丙酸，丁酸含量最低，粪便中含量分别为(66.12±29.36)μmol/g，(22.50±12.98)μmol/g，(8.27±5.69)μmol/g，相对比值为8.00∶2.72∶1，血清中三者分别为(242.29±29.70)μmol/L，(16.61±2.63)μmol/L，(1.48±0.51)μmol/L，相对含量比为163.71∶11.22∶1。无论在血清中或是粪便中，CKD患者中丁酸含量较正常对照组显著减少(P<0.05)。两组血清中丙酸含量差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

图1 SCFAs气相色谱图 A：标准品色谱图；B：正常对照组粪便色谱图；C：正常对照组血清色谱图(1：乙酸；2：丙酸；3：丁酸)

表1 正常对照组及CKD患者粪便及血清中的SCFAs含量 (M±SD)

3 讨论

本研究在CKD与正常对照组的粪便与血清中均检测到SCFAs。与正常对照组相比，CKD患者无论是粪便还是血清中，SCFAs的含量都降低，由此可见，疾病状态下，由于肠道菌群的结构改变,导致其代谢产物SCFAs具有明显的差异性。越来越多的研究证实，给予CKD患者类似于SCFAs的高纤维的饮食可以明显改善疾病状况[16-17]。一项Meta分析显示，增加饮食中膳食纤维可以明显降低血清中尿素与肌酐的含量[18]。

早期检测SCFAs的方法为滴定法，但此法特异性与准确性均很差，现已很少使用。随着技术发展与仪器精准度的提高，气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳(CE)以及原子吸收分光光度法是目前常见的检测方法,广泛应用于实际工作中。但由于SCFAs具有极性大，挥发性强和水溶性高等特点，利用气相色谱法，在衍生化或液-液萃取处理过程中，会因操作步骤过多而损失。毛细管电泳法存在灵敏度相对较低的缺点[19-20]。

本研究采用GC/MS，简化了对样品的前期处理过程，减少了SCFAs的挥发损失，利用色谱柱对不同物质吸附能力的差异，提高检测效率，结果分析方便迅速。以GC/MS检测CKD患者中粪便和血中SCFAs，为临床提供了一种快速、简便、精确的检测方法。

CKD患者粪便与血清中SCFAs的含量明显低于正常对照组，利用灵敏度高、操作简便的GC/MS可及时检测血清及粪便中SCFAs的含量，便于监测CKD患者疾病进程，以及观察其诊疗效果，为临床检验提供了一种新思路。本研究发现CKD粪便及血清中，丁酸含量较正常对照组减少，差异有统计学意义，因此，丁酸可能应用于监测肾衰进程，以及可能成为肾衰辅助诊断的参考指标。