血清高尔基体跨膜糖73蛋白及其他生物标志物联合检测在AFP阴性小肝癌诊断中的意义

范旭，单珊，刘立伟，贾继东

全球范围内，原发性肝细胞癌(primary hepatocellular carcinoma，PHC)发病率位于常见癌症的第五位且仍呈上升趋势，死亡率高居第三位[1]。因此，PHC早期诊断对后期治疗方案的确定至关重要。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是PHC诊断中最实用的血清生物标志物。然而，AFP诊断的敏感性和特异性较低，尤其是在肿瘤较小的情况下[2]。近年来，晶状体库氏凝集素反应性甲胎蛋白(lens culinaris agglutinin- reactive alpha-fetoprotein，AFP-L3)、高尔基体跨膜糖蛋白73(golgi glycoprotein 73，GP73)、des-γ-羧基凝血酶原(des-gamma-carboxy prothrombin，DCP)、甘氨聚糖3(glypican 3，GPC3)被认为是早期检测原发性肝癌的潜在血清生物标志物[3]。研究表明PHC患者血清GP73水平明显升高，可能相较于AFP，GP73更具有早期诊断PHC的生物学价值，但同样有研究报告得出相反的结果[4]。研究表明，AFP-L3诊断肝癌的敏感性和特异性分别为72.3%和97.2%，对AFP含量低、肿瘤体积小的PHC具有早期诊断的价值。尤其，AFP-L3所占AFP的比例AFP-L3(%)的诊断价值得到认可。DCP和GPC3对PHC的早期诊断、肝内转移及预后有一定意义，但无明显优于AFP。显然上述血清生物标志物有助于PHC的诊断，但其仍存在一定的自身局限性[5]。近年来，越来越多的研究支持GP73、AFP-L3和DCP单独或联合检测在PHC诊断中具有一定的价值，但对于AFP阴性的小肝癌尚未进行特异性研究。本文选取45例PHC患者，对其进行血清GP73、AFP-L3(%)、GPC3、DCP、CA199、铁蛋白(FER)和癌胚抗原(CEA)水平的检测；同时对其联合检测诊断小肝癌的方法进行评价。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

选取2018年9月至2019年6月于北京市友谊医院肝病科门诊及住院患者和健康体检人群，共纳入145例患者和健康人群。纳入及排除标准：①PHC组45例，其中，男32例，女13例，平均年龄53岁，45例小肝癌均符合《2018年美国肝病学会肝细胞癌治疗指南》[6]的诊断标准，单发病灶≤3 cm，无血管侵犯或转移，血清AFP浓度1.11～8.98 μg/L，根据报告截点108.00 μg/L为限，本研究纳入患者血清AFP均为阴性。②非PHC疾病组55例，其中，男38例，女17例，平均年龄58岁，其中病毒性肝炎20例，肝硬化15例，除肝癌外消化系统恶性肿瘤20例；20例乙型或丙型肝炎患者表面病毒抗原都为阳性，15例肝硬化患者已排除肝脏占位性病变，20例除肝癌外的消化系统恶性肿瘤(胃癌5例、胆管癌7例、大肠癌4例、结肠癌4例)。③另外，收集健康对照45例，其中，男25例，女20例，平均年龄55岁，经常规生化和免疫学检查排除肝炎、肝硬化、肝胆囊肿、良恶性肿瘤等疾病。本研究获得医院伦理委员会批准，患者知情同意。

1.2 研究方法

收集患者空腹静脉血1 mL，以3 000 r/min离心15 min，分离血清，分析前冻存于-80 ℃下。测定各组血清AFP-L3、GP73、DCP、GPC3、CA199、FER和CEA水平，比较各组间不同生物标志物的水平。GP73、DCP、GPC3检测按试剂盒说明书(上海瑞奇科技有限公司)进行酶联免疫吸附分析；AFP-L3采用微球蛋白UMN分离，CA199、FER、CEA、AFP-L3和AFP总含量检测采用电化学免疫法测定(除AFP-L3分离纯化试剂盒购自北京瑞晶生物科技有限公司，其余试剂盒购自上海罗氏诊断产品有限公司)，计算AFP-L3在总AFP中的百分比为AFP-L3(%)。在整个工作中使用CODA自动微孔板分析仪和罗氏2010电化学发光分析仪。

1.3 诊断验证

对上述不同标志物诊断效能进行验证方法如下：验证每种标志物的诊断效能时，根据该标志物浓度由高到低进行排序，并按照三分位点分别将PHC组、非PHC组和健康组分为三组。每次从每组生物标志物中随机抽取4例作为验证数据集，其余全部剩余数据作为样本集。比较验证数据集和样本集的ROC曲线差异。每种生物标志物或联合诊断的数据验证分别重复进行5次，计算5次灵敏度、特异性和准确性的均值和标准差进行差异比较。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。Kolmogorov-Smirnov检验后发现测量数据呈偏态分布，计量数据以M(Q1-Q3)表示；组间比较采用Kruskal-Wallis检验，多重比较采用Nemenyi 检验；计数数据比较采用2检验。采用二元Logistic回归分析，根据受试者的ROC分析和AUC建立联合诊断的预测模型，评价诊断的敏感性和特异性。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血清生物标志物水平的比较

各组间血清AFP-L3(%)、GP73、DCP、GPC3、CA199、CEA水平均呈显著性差异(P<0.01)，PHC组高于其它各组(P<0.01)，而非PHC组高于健康组(P<0.05)，见表1。

2.2 单项生物标志物及联合诊断对PHC的诊断价值

非PHC组和健康组作为非原发性肝癌组，ROC表示单项和联合诊断的诊断价值，结果显示单用AFP-L3(%)、GP73、DCP、GPC3、CA199、FER和CEA的截止值分别为14.8%、75.1 μg/L、40.5 μg/L、29.4 μg/L、68.1 U/mL、278.1 μg/L和2.7 μg/L。见表2和图1。PHC组AFP-L3(%)、GP73、DCP、GPC3、CA199、FER和CEA阳性率分别高于非PHC组和健康组(P<0.01)，见表3。在单项指标检测中，单用GP73诊断PHC组的敏感性和准确性最高，分别为73.3%和85.5%，单用GPC3诊断PHC组的特异性最高，为97.0%。联合诊断的灵敏度、特异性、准确率和AUC分别为84.4%、94.0%、91.7%和0.883，可见联合诊断的特异性、敏感性和准确性最高，见表2和表4。

表1 三组血清生物标志物水平比较[M(Q1-Q3)]

备注：*与PHC组比较,P<0.05

表2 各血清生物标志物ROC曲线下面积

图1 各血清生物指标诊断PHC的ROC曲线 注：1：GP73+GPC3；2：GPC3；3：CA199；4：FER；5：DCP；6：CEA；7：GP73；8：GP73+AFP-L3；9：AFP-L3；10：GP73+AFP-L3+GPC3+DCP；11：GP73+AFP-L3+GPC3+DCP+CA199+FER+CEA；12：GP73+DCP

2.3 PHC诊断中生物标志物单项及联合检测的验证

根据方法中的验证方法，通过比较发现，各个标志物的验证集的灵敏度、特异性和准确率分别与样本集一致，见表5。

3 讨论

早期诊断是治疗原发性肝癌、改善患者预后的关键[7]。临床上较为常见的肝癌血清学诊断标记物为AFP，但其敏感性和特异性均不理想[8]。研究表明80%的小PHC患者血清AFP无明显升高，对直径>3 cm和≤3 cm的PHC患者，AFP敏感性分别为52%和25%[9]。相较于单一血清学标记物，多个生物标志物联合诊断可能具有更好的诊断效果[10]。因此，我们评估了新的生物标记物及其联合诊断指标对小PHC的诊断价值。

表3 三组血清生物标志物阳性率[n(%)]

备注：*与PHC组两两比较有差异。

表4 各血清生物标志物诊断PHC的敏感度、特异性及准确度 [%(n/N)]

注：45例为PHC例数，100例为非PHC组加健康组总例数，145例为总例数

表5 验证集与样本集诊断效能的对比

近年来，AFP-L3(%)、GP73、DCP、GPC3已被公认为早期检测PHC的血清生物标志物。AFP-L3是AFP亚型之一，AFP-L3与总AFP的比值已用于PHC的早期诊断，有研究表明PHC患者血清AFP-L3浓度高于慢性肝病患者，其诊断敏感性和特异性分别为72.3%和97.2%。其他研究表明AFP-L3与肝脏疾病的进展、肿瘤的分化程度和生物学恶性行为有关[11-12]。本研究结果表明PHC组AFP-L3(%)水平及阳性率均显著高于其他组，其AUC为0.821，具有较高的敏感性和特异性。因此，AFP-L3(%)有望成为诊断PHC的一种优于AFP的生物标志物，特别是对低水平AFP、肿瘤体积较小的肝癌。

GP73是一种跨膜高尔基糖蛋白，含有400个氨基酸残基。虽然GP73在病毒性肝炎和脂肪肝中表达较为活跃，在PHC患者中其表达量较低，但仍有相关研究表明GP73是PHC最有希望的血清生物标志物之一。由于部分研究表明血清GP73与肝细胞癌无关，因此GP73在PHC诊断中的潜在优势仍然存在一定争议[13-15]。本研究结果表明，PHC组的血清GP73水平和阳性率均显著高于其他各组。此外，单用GP73诊断小PHC的AUC为0.834，敏感性和特异性也同样较高。上述结果在一定程度上支持了血清GP73单独诊断PHC的临床价值，并且对于低水平AFP、小PHC患者具有一定的潜在诊断意义。

此外，我们还发现小PHC组DCP和GPC3的水平及阳性率均明显高于其他组，说明其对小PHC的诊断具有一定临床意义[16]。但本研究结果显示两者的敏感度分别为51.1%和55.6%，与AFP相比无明显优势。目前，DCP和GPC3在PHC诊断中的作用仍存在争议。据报道，DCP对原发性肝癌的诊断敏感性可达87%，特别是对肝内转移和预后的判断具有较优的优势。GPC3在80%的原发性肝癌患者中有较高的特异性和高表达，且在良性肝病患者中无表达，对良恶性肿瘤的诊断有一定参考价值。但也有报道指出DCP和GPC3的诊断价值并不优于AFP，甚至不能作为诊断PHC的有用生物标志物[17-19]。因此，对于上述两种标记物还需后续进一步研究。CA199是诊断消化系统恶性肿瘤常用的血清生物标志物，但其特异性对PHC诊断较低[20]。单独检测CEA或FER对PHC的诊断有一定意义，但特异性较低。

单一生物标记物诊断PHC的敏感性和特异性有限，这使联合诊断成为目前研究热点[21]。本研究结果显示将7种生物标志物进行联合检测，其灵敏度、特异性、准确率和AUC分别达到84.4%、94.0%、91.7%和0.883，显示出比单一生物标志物更好的诊断效果。7种生物标志物联合检测的特异性不是最高的，但已经令人满意，交叉验证也证实了这种诊断的有效性。

本文入组患者数量有限，相对数据样本量较小，更明确的结论还需要后续进一步验证。本研究仍在进行中，后续将用更全面的数据进一步校正敏感性和特异性，继续验证7种血清生物标志物联合诊断对早期诊断小PHC的意义，寻求更有意义的指标。

综上所述，联合诊断指标对于小PHC的诊断价值相对较高，单一指标中GP73有相对较优的诊断效能。但仍需后续进一步收集临床数据验证，并寻求更为有价值的指标。