N-乙酰半胱氨酸对非酒精性脂肪性肝炎模型小鼠肝细胞线粒体自噬的影响

张宁萍 方颖 刘雪静 谢黎 吴健 沈锡中

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)发病率日益升高，但其发病机制尚未明确。NASH的肝细胞以线粒体异常为特征，线粒体损伤是促进单纯性脂肪肝向NASH进展的重要因素之一[1- 2]。正常生理条件下，受损线粒体可以通过自噬机制(即线粒体自噬)被及时清除[3]。肝细胞自噬缺陷与脂肪滴堆积、胰岛素抵抗、NLRP3炎症小体活化有关[4]。N-乙酰半胱氨酸(NAC)是还原型谷胱甘肽的前体，有保护肝细胞作用，用于药物性肝损伤的治疗[5]。研究者的前期研究提示，NAC能改善游离脂肪酸诱导的大鼠原代肝细胞线粒体自噬功能缺陷[6]，但其体内作用尚不明确。本研究通过建立高脂高糖诱导的NASH小鼠模型，以NAC进行干预，观察NAC对NASH小鼠肝细胞线粒体自噬的影响。

材料与方法

一、实验动物

清洁级C57BL/J6小鼠18只，6～8周龄，雄性，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。饲养于复旦大学上海医学院实验动物中心。

二、主要试剂与仪器

主要仪器：荧光分光光度计(Nanodrop)，PCR仪(BIO-RAD)，电泳仪(BIO-RAD)，全自动化学发光图像分析系统(Tanon)，Real-Time定量PCR仪(Thermo)，快速型血糖仪(罗氏公司)，单电子激光共聚焦显微镜(Leica)，倒置显微镜(Nikon)，荧光显微镜(Nikon)。主要试剂：甘油三酯检测试剂盒(南京建成生物研究所)，Masson染色试剂盒(武汉谷歌生物科技有限公司)，抗体：β-actin(Santa Cruz)，COX IV(Abcam)，LC3B(Novus)，Parkin(Proteintech)，PINK1(Santa Cruz)，P62(Proteintech)。

三、动物分组与模型建立

小鼠分别于耳缘打孔编号，在适应性喂养1周后随机分为3组：正常饮食对照组，高脂高糖诱导NASH组(HFCD)，高脂高糖喂养同时添加NAC干预实验组(HFCD+NAC)，每组6只。高脂高糖诱导NASH给药方法参见本课题组研究论文[7]，HFCD+NAC组在高脂高糖喂养同时按照每日150 mg/kg经饮用水给予NAC干预。NAC配制方法：1L饮用水(高糖水)中加入0.45 g NAC，调整pH值为7.0。分别于喂养16周后对3组小鼠实施安乐死，并保留肝脏和外周血液标本。

四、测定指标及方法

(一)肝脏指数及组织病理学检查 新鲜肝组织完整分离后称重，计算肝脏指数=肝脏湿重/体重×100%。福尔马林固定肝组织后石蜡包埋切片，HE染色及Masson染色后光镜下观察肝脏变化。

(二)血清生化指标检测 小鼠眼眶取血，3 000 rpm离心10 min后分离血清，由全自动生化仪检测血清ALT、AST、IL-1β。空腹血糖通过取小鼠尾静脉血由罗氏快速血糖仪检测。

(三)肝组织甘油三酯定量检测 采用南京建成生物研究所甘油三酯(TG)检测试剂盒(A110-2)检测。过程按照说明书进行。

(四)组织免疫荧光染色 肝组织冰冻切片用预冷丙酮固定10 min，PBS 洗涤3次。3% BSA室温封闭30 min。擦干封闭液后加一抗(COX IV标记线粒体，LC3B标记自噬)，平放于湿盒内4℃过夜。第二天PBS 洗涤3次。加二抗后避光室温孵育1小时。PBS 洗涤3次。加DAPI染液，避光室温孵育10 min。PBS 洗涤3次。盖玻片封片后在单电子激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

(五)RT-PCR检测 提取肝脏总RNA后经荧光分光光度计检测RNA定量。取2 μg总RNA为模板，配置20 μL反应体系，按试剂盒说明进行逆转录。RT-PCR每个目的基因或内参均配制3管。反应体系为：SYBR green MIX 10 μL，目的基因/内参正引物 1.0 μL，目的基因/内参正引物 1.0 μL，cDNA 2.0 μL，ddH2O 6.0 μL。PCR反应条件：95℃ ×10 min，循环45次，95℃ ×15秒，60℃ ×1 min，绘制熔解曲线。结果用目的基因与内参基因的相对表达量表示，计算方法采用ΔΔCT法。

(六)Western blot检测 肝组织匀浆后，12 000 g离心5 min，收集上清得到总蛋白溶液。经15%-8%浓度的SDS-PAGE凝胶电泳分离后，转移到PVDF膜。将PVDF膜放入5%的脱脂牛奶-TBST封闭1 小时。分别4 ℃孵育Parkin、PINK1、LC3B、P62、β-actin一抗过夜。TBST洗涤后，二抗室温孵育30 min，TBST 洗涤3次。将ECL发光液加在PVDF膜的蛋白面上反应1-2 min，吸除多余发光液后放入全自动化学发光图像分析系统拍照。

五、统计分析

近似正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，计数资料采用n(%)进行统计描述。多组间计量资料的比较采用ANOVA进行检验，组间多重比较采用LSD法进行检验。计数资料比较采用χ2检验或Fisher精确卡方检验。统计分析应用SPSS 18.0或Graphpad 6.0软件，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、 NAC对NASH小鼠肝脏的影响

对照组小鼠肝脏外形正常，呈鲜红色，质地柔软。HFCD组(图1B)肝脏逐渐增大，呈黄白色，表面可见颗粒样改变。HFCD+NAC组(图1C)肝脏大体组织形态变化较HFCD组(图1A)轻。HE染色对照组肝细胞形态正常，肝小叶内结构完整，肝索排列整齐有序，肝细胞未见变性、坏死或炎性细胞浸润。HFCD组肝细胞逐渐出现小泡型及大泡小泡混合型的脂肪沉积及部分坏死，且范围由散在加重至广泛。汇管区周围炎症细胞浸润，炎性细胞浸润以大量单个核细胞为主，细胞核被脂滴挤压到细胞边缘(图1E)。HFCD+NAC组肝细胞炎症及脂肪沉积情况较HFCD组轻(图1F)。Masson染色，HFCD组及HFCD+NAC组肝组织纤维化较对照组显著，但相对于HFCD组，HFCD+NAC组肝组织纤维化无明显减轻(图1G-I)。

图1 对照组、HFCD、HFCD+NAC组小鼠肝脏大体

与对照组相比，HFCD组及HFCD+NAC组小鼠体质量及肝重增加，空腹血糖、肝脏甘油三酯及血清ALT、AST、白细胞介素1-β(IL-1β)升高，其中HFCD+NAC组较HFCD组肝脏甘油三酯及血清ALT、AST、IL-1β降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

二、 NAC对NASH小鼠肝细胞线粒体自噬的影响

小鼠肝组织冰冻切片以COX IV和LC3B双重染色分别标记线粒体和自噬小体，在共聚焦纤维镜下观察比较3组小鼠肝组织内线粒体自噬的水平可见：对照组小鼠肝组织中的线粒体(COX IV)呈点状均匀分布，HFCD组肝组织内COX IV表达量下降，且为团块状聚集，提示线粒体损伤逐渐加重。同时，HFCD组LC3B表达也明显降低。相对于HFCD组，HFCD+NAC组COX IV和LC3B表达量升高，提示线粒体自噬较HFCD组活跃。见图2A。

RT-PCR法检测小鼠肝脏线粒体自噬相关基因Atg5、Atg7、Parkin/PARK2、PINK1表达量，HFCD组及HFCD+NAC组均较对照组下降，但相对于HFCD组，HFCD+NAC组的线粒体自噬相关基因在mRNA水平上升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2D。

蛋白印迹法检测各组小鼠肝组织内Parkin、PINK1的蛋白表达及自噬水平变化。结果显示，HFCD组小鼠较对照组肝组织内Parkin、PINK1表达降低，同时LC3B II/I比值降低，P62表达量增高。提示HFCD组小鼠肝细胞线粒体自噬水平降低。HFCD+NAC组较HFCD组线粒体自噬水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2B-C。

讨 论

还原型谷胱甘肽是存在于肝脏中的抗氧化分子，能通过抗自由基作用抑制线粒体通透性改变、调控凋亡。NAC是谷胱甘肽的前体，具有抗氧化剂作用和血管舒张作用，可以减轻组织缺氧，在临床中常用于药物性肝损伤、急性肝衰竭等肝病的治疗[5, 8-9]。

表1 对照组和实验组小鼠一般情况、血生化指标比较(±s)

A.小鼠肝组织冰冻切片免疫荧光双染色。B.小鼠肝细胞线粒体自噬相关蛋白Western blot显影结果。C.Western blot相对灰度比。D.小鼠肝细胞线粒体自噬相关基因Atg5、Atg7、Parkin/PARK2、PINK1的mRNA相对表达量。

图2NAC对NASH小鼠肝细胞线粒体自噬的影响

线粒体异常是NASH患者肝细胞病变的特征之一[10-13]。线粒体对氧化应激损伤十分敏感。NASH进程中高游离脂肪酸造成的脂毒性导致肝细胞损害，刺激生成过量ROS，无法清除时蓄积的ROS会攻击线粒体造成线粒体肿胀，线粒体内呼吸链复合体酶活性下降，引起线粒体途径的内源性ROS(mtROS)生成增多及ATP合成减少，导致线粒体损伤和功能障碍。外源性ROS和mtROS还可以直接造成线粒体DNA(mtDNA)断裂和损伤[13-14]。通常受损伤的线粒体通过线粒体自噬途径被清除，并减少线粒体途径的内源性ROS生成，保护线粒体功能稳定，确保应激的细胞存活[3, 15]。线粒体自噬下降，细胞防卫功能缺失，过量的mtROS累积攻击线粒体造成线粒体膜破裂，使线粒体向胞质内释放细胞色素C凋亡诱导因子等凋亡相关蛋白，从而诱导细胞凋亡以及导致细胞死亡[4]。

我们前期研究证实，NASH小鼠肝细胞线粒体自噬水平下降诱导NLRP3炎症小体活化，是导致NASH肝细胞炎症进展的因素之一。同时，体外细胞实验提示，NAC可以通过抑制细胞ROS和mtROS形成，部分恢复线粒体自噬水平，从而抑制NLRP3炎症小体活化[6]。本研究通过NASH模型小鼠进一步证实，添加NAC减轻了高脂高糖诱导的NASH小鼠肝脏细胞脂肪沉积和炎症。相对于HFCD组，HCFD+NAC组小鼠肝细胞受损的线粒体自噬水平升高，且部分线粒体功能恢复。提示NAC可能通过改善肝细胞线粒体自噬，进而减轻肝细胞炎症进展。