基于抗氧化能力检测白藜芦醇产品中反式异构体含量的方法

王思渊，郭 彬，陈 蓉，郝 刚*，梅建凤

(1 苏州市药品检验检测研究中心，苏州 215000；2 浙江工业大学 药学院，杭州 310014)

白藜芦醇是一种作用广泛的天然多酚类化合物，是在植物遭受外界胁迫时产生的一种植物抗毒素，主要存在于葡萄等浆果类植物中，目前已在100种植物中被发现。近年来的研究表明，白藜芦醇具有多种生物活性和药理作用，尤其在抗氧化、抗肿瘤和治疗心血管疾病方面有非常显著的作用，可广泛应用于医药、食品、化妆品和保健品等领域[1-2]。白藜芦醇能够通过与自由基反应来降低自由基活性，阻止自由基的进一步链式反应，达到清除自由基的效果[3-4]。研究发现，白藜芦醇的强抗过氧化作用与其结构密切相关，由于反式结构分子都位于一个平面，捕捉自由基后，表现出更加稳定的状态，反式构型比顺式构型对Cu2+鳌合能力强，抑制诱导的低密度脂蛋白氧化作用也更为明显[5]。在生物合成和应用的产品中，白藜芦醇往往以顺式构型和反式构型混合的形式存在，因此，产品中反式构型的含量检测就变得尤为重要[6]。目前市售白藜芦醇产品多不区分顺反式异构体，仅表述为白藜芦醇纯度。现有顺反式构型分析的方法主要以特殊色谱条件下的高效液相色谱法为主，存在耗时长、耗材昂贵等缺点[7-8]，目前尚无快速高通量分析方法的报导。本文利用白藜芦醇顺反式异构体间抗氧化能力的差异，建立ABTS+·清除率法测定白藜芦醇产品反式构型的含量，为白藜芦醇的推广利用提供快速有效的检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

Spectra Max Plus 384型全波长酶标仪(赛默飞世尔科技有限公司)；XSE205型分析天平(梅特勒-托利多国际有限公司)；反式白藜芦醇和顺式白藜芦醇标准品(HPLC纯度均≥99%，Cayman Chemical有限公司)；总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS法，上海碧云天生物技术有限公司)；总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS法，西安赫特生物科技有限公司)；抗氧化检测试剂盒(西格玛试剂)；其余试剂均为市售分析纯；5批次不同白藜芦醇原料药采购自市场。

1.2 溶液的配制

将ABTS溶液与氧化剂溶液等体积混合均匀，配制ABTS母液。ABTS母液室温避光存放16 h后，以80%乙醇稀释至A734为(0.7±0.05)，制成ABTS工作液。精密称定反式白藜芦醇和顺式白藜芦醇标准品溶于80%的乙醇中制成对照品溶液。精密称定5批次不同白藜芦醇原料药溶于80%的乙醇，配制成0.1 mmol/L的溶液，作为供试品。

1.3 白藜芦醇顺反式异构体抗氧化能力测定

参照Miller等[9]和Rice-Evans等[10]的研究方法，分别精密称取反式白藜芦醇和顺式白藜芦醇标准品溶于80%的乙醇，配制成0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mmol/L的溶液。在96孔板上加入 200 μl 的ABTS工作液，加入10 μl样品后，轻轻摇匀。室温孵育6 min后，测定白藜芦醇顺反式异构体各浓度A734，并按公式(1)计算ABTS+·清除率。

(1)

式(1)中：A1为样品+ABTS 试剂的A734；A2为80%乙醇+ABTS 试剂的A734；A3为样品+80%乙醇的A734。

1.4 白藜芦醇异构体含量标准曲线的建立与方法学研究

以0.1 mmol/L的反式白藜芦醇和顺式白藜芦醇标准品溶液配制成体积比为0∶100、20∶80、50∶50、80∶20和100∶0的混合溶液，即混合溶液中反式白藜芦醇含量比例分别为0%、20%、50%、80%和100%。按“1.3”所述方法测定各比例溶液ABTS+·清除率，以反式白藜芦含量比例为横坐标，ABTS+·清除率绘制标准曲线，得回归方程。以80%反式白藜芦醇混合溶液作为样品进行方法学研究，考察反应溶液的稳定性、重复性、耐用性。

1.5 白藜芦醇产品含量检测

将采购获得的5批不同厂家的原料药白藜芦醇，精密配制成浓度为0.1 mmol/L的溶液，测定样品的ABTS+·清除率，依据“1.3”中的标准曲线，由清除率计算出反式白藜芦醇的浓度比例，再将比例乘以0.1 mmol/L，即可计算出样品反式白藜芦醇的含量。

2 结果

2.1 白藜芦醇顺反式异构体抗氧化能力比较

不同浓度的顺反构型白藜芦醇异构体的ABTS+·清除率如图1所示。在低浓度条件下，由于酶标仪检测限与试剂盒灵敏度的影响，测得的顺反式白藜芦醇溶液ABTS+·清除率差异不大。随着2种白藜芦醇异构体浓度的增加，测得的顺反式白藜芦醇溶液ABTS+·清除率差异显著，在浓度为0.1 mmol/L时，顺式白藜芦醇溶液ABTS+·清除率为13.2%，反式白藜芦醇溶液ABTS+·清除率为81.5%，是前者的6.17倍。但随着溶液浓度的进一步提升，由于试剂盒反应能力饱和，超出线性范围，测得的顺反构型白藜芦醇溶液ABTS+·清除率差异开始变小。故选定浓度为0.1 mmol/L的反式白藜芦醇/顺式白藜芦醇混合溶液，构建白藜芦醇异构体含量标准曲线。

图1 白藜芦醇顺反异构体的ABTS+·清除率曲线

2.2 白藜芦醇异构体含量标准曲线的建立

按前文所述方法，测定浓度为0.1 mmol/L时，反式白藜芦醇和顺式白藜芦醇混合液中不同反式异构体含量比例溶液的ABTS+·清除率，绘制的标准曲线见图2。

图2 不同含量比例的反式白藜芦醇的ABTS+·清除率标准曲线

由图2得出的反式白藜芦醇含量比例与ABTS+·清除率之间的回归方程为y=0.677x+11.26，R2=0.9943，说明两者在反式白藜芦醇含量比例0%～100%之间线性关系良好。依据这个回归方程，只要测定白藜芦醇样品在浓度为0.1 mmol/L时的ABTS+·清除率，即可计算出反式白藜芦醇的含量比例，比例乘以0.1 mmol/L，即可得到样品中反式白藜芦醇含量。如果样品的ABTS+·清除率小于11.26%(横坐标为零时的纵坐标值)，不适用本快速检测方法测定。

2.3 方法学研究

2.3.1溶液稳定性考察

将配制好的ABTS工作母液与ABTS工作液室温避光存放12、24、36和48 h，考察反应溶液的稳定性。发现配制好的ABTS工作母液室温避光存放，在48 h内稳定。制成的ABTS工作液室温避光存放，在24 h内稳定。由于白藜芦醇顺反式异构体在光照条件下存在可逆互变反应，建议供试品溶液临用现配并避光保存。

2.3.2重复性试验

取80%反式白藜芦醇混合溶液6份，按“2.1”所述方法测定，考察重复性。测得反式白藜芦醇含量均值为79.5%，相对偏差为0.52%(n=6)。结果见表1。

表1 重复性试验结果

2.3.3耐用性考察

取80%反式白藜芦醇混合溶液为供试品，用3种不同品牌试剂盒测定，考察方法耐用性。测得反式白藜芦醇含量均值为79.6%，标准偏差为0.77%，结果见表2，表明该方法耐用性良好。

表2 耐用性实验结果

2.4 白藜芦醇产品中反式异构体含量的检测

按前文所述方法，测定了5个白藜芦醇原料药中反式白藜芦醇的含量，结果见表3。从表3数据可以看出，测得的5个白藜芦醇原料药样品中反式异构体含量为其标示量差值百分比均小于1%，说明通过测定白藜芦醇产品的抗氧化能力，计算反式白藜芦醇的含量的方法可行，可应用于白藜芦醇相关产品中反式构型含量的检测。

表3 白藜芦醇原料药中反式异构体的含量测定结果

3 讨论

现有的白藜芦醇顺反式构型分析的方法主要以特殊色谱条件下的高效液相色谱法为主，存在耗时长、耗材昂贵等缺点。由于白藜芦醇顺反式异构体存在可逆互变反应，耗时长的分析方法不利于结果的准确性，需建立快速高通量的分析方法。本文利用反式白藜芦醇ABTS+·清除率与顺式白藜芦醇之间的差异性，建立了浓度均为0.1 mmol/L条件下，两者混合溶液中反式异构体含量比例与ABTS+·清除率之间关系的标准曲线，得到回归方程。只要测定样品在浓度为0.1 mmol/L时的ABTS+·清除率，再由回归方程计算出反式白藜芦醇的含量比例，比例乘以0.1 mmol/L，即可得到样品中反式白藜芦醇含量。结果表明，本研究建立的方法具有较高的稳定性、重复性和耐用性。用该方法测定了5个白藜芦醇原料药产品，结果与它们标示量的差值百分比均小于1%，说明该方法能够快速可靠、重复性好地测定白藜芦醇产品反式异构体的含量。因此，本研究为白藜芦醇反式异构体快速检测方法的建立提供了实验依据。