脂联素对高脂饮食诱导的胰岛素抵抗子宫内膜癌裸鼠移植瘤生长的影响

何 珊 邓 露 蔡志福 张洁清 李 力

作者单位：530021 南宁 1广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科；422000 邵阳 2邵阳市中心医院影像科

子宫内膜癌是全球第六大常见恶性肿瘤，位列女性癌症死亡的第14位，近年来发病呈年轻化趋势［1］。子宫内膜癌发病机制较复杂，研究发现胰岛素抵抗是增加子宫内膜癌发病风险的重要分子机制之一，而肥胖不仅可引起胰岛素抵抗，也可诱发子宫内膜癌发生［2-3］。脂联素（adiponectin，APN）是由脂肪细胞特异分泌的一种生物活性分子，与肥胖、胰岛素抵抗等多种疾病有关，是胰岛素的增敏剂［4］。近年来，研究报道脂联素可能通过改变激素和细胞因子水平间接影响与肥胖相关恶性肿瘤的发生发展，如子宫内膜癌、乳腺癌、白血病与结直肠癌等，其中循环中脂联素水平与血清中的胰岛素浓度呈负相关，从而增加患癌风险［5-6］。但是脂联素对存在胰岛素抵抗的子宫内膜癌的作用尚不明确。本研究通过高脂饮食诱导裸鼠胰岛素抵抗后在体内接种子宫内膜癌细胞，构建胰岛素抵抗及子宫内膜癌移植瘤双重动物模型，探讨脂联素对裸鼠移植瘤生长的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料及试剂

人子宫内膜癌细胞系HEC-1B由北京大学人民医院馈赠，接种于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM高糖培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，用0.25%胰蛋白酶消化传代。40只SPF级BALB/C雌性裸鼠购自广西医科大学动物中心，3～4周龄，体重11～12 g。饲养于SPF级动物房，实验程序由广西医科大学附属肿瘤医院伦理委员会审核批准。

DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均购自美国Sigma公司；青霉素-链霉素购自碧云天公司；脂肪供能占45.0%的高脂饲料（high-fat diet，HFD）购自北京博泰宏达饲料有限公司；脂肪供能占12.9%的普通饲料（normal diet，ND）购自北京科澳协力饲料有限公司；鼠脂联素购自Biovendor Technology公司；生物合成人胰岛素注射液购自巴西诺和诺德公司；小鼠甘油三脂ELISA试剂盒、小鼠胰岛素ELISA试剂盒、小鼠总胆固醇ELISA试剂盒均购自上海华壹生物有限公司；小鼠血脂联素ELISA试剂盒购自武汉博士德生物有限公司。

1.2 双重裸鼠模型的建立及分组

40只裸鼠普食适应性喂养1周后，随机分为高脂组和普食组，每组20只，继续喂养HFD和ND，其余条件保持一致。每日记录裸鼠的平均进食量和平均能量摄入量，每周记录裸鼠体重变化情况。第11周，将处于对数生长期的0.2 mL HEC-1B细胞悬液（5×107/mL）接种于裸鼠左腹皮下。瘤体长至0.5 cm时，将高脂组荷瘤裸鼠随机分为HFD+APN组和HFD组，普食组荷瘤裸鼠随机分为ND+APN组和ND组，每组均为10只。HFD+APN组和ND+APN组荷瘤裸鼠以 25 μg·kg-1·d-1剂量腹腔注射脂联素，ND 组和 HFD组荷瘤裸鼠以1.25 mL·kg-1·d-1剂量注射0.9%氯化钠，连续给药2周，隔日1次。每3 d测量裸鼠体重和移植瘤的长径（a）和短径（b），绘制肿瘤体积（V=0.5×a×b2）生长曲线。14周后以摘眼球取血法处死裸鼠，分离瘤体，称重，测量移植瘤体积。

1.3 糖代谢相关指标的检测

高脂组和普食组喂养10周后，禁食6 h，尾静脉取血检测空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），两组分别随机抽取10只裸鼠，测定空腹血胰岛素（fasting serum insulin，FINS）。采用稳态模型评估法评估胰岛素抵抗指数（HOMA-IR），计算方法：HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。然后依次腹腔注射50%葡萄糖注射液（按2 g葡萄糖/kg剂量）和人胰岛素注射液（按0.75 U/kg剂量），进行糖耐量试验和胰岛素耐量试验，分别于0 min、30 min、60 min、90 min、120 min 测定裸鼠血糖值并绘制血糖曲线。14周后，按照ELISA试剂盒操作方法测定HFD+APN组、HFD组、ND+APN组和ND组荷瘤裸鼠的FBG、FINS、血清甘油三脂（triglyceride，TG）、血清总胆固醇（total cholesterol，TC）和血清脂联素水平，同时计算HOMA-IR。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计学处理。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组均数比较采用独立样本t检验；多组均数比较采用单因素方差分析，若组间差异有统计学意义，进一步两两比较采用Tukey检验。以双则P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 裸鼠一般情况

40只裸鼠普食适应性喂养1周后，高脂组和普食组裸鼠平均体重比较无统计学差异［（11.54±0.67）g vs（11.55±0.61）g，t=0.074，P=0.941］。分别予以 HFD 和ND喂养10周后，高脂组裸鼠日平均进食量明显低于普食组［（2.78±0.50）g vs（3.12±0.41）g，t=3.589，P=0.001］，但日平均能量摄入量高于普食组［（54.78±9.77）kJ vs（45.57±6.05）kJ，t=5.550，P＜0.001］。与普食组比较，高脂组裸鼠平均体重较大［（22.16±1.14）g vs（24.41±1.00）g，t=6.627，P＜0.001］，且高脂组裸鼠体长稍大于普食组，体形较大，皮下脂肪丰满。见图1。

图1 高脂组和普食组裸鼠的生长情况Fig.1 Growth of nude mice in the high-fat diet group and the normal diet group

随后两组裸鼠接种子宫内膜癌HEC-1B细胞，5 d后均可触及绿豆大小边界清晰的结节样肿物并逐渐增大，成瘤率均为100%，表明成功构建裸鼠人子宫内膜癌移植瘤模型。

2.2 高脂饮食对裸鼠胰岛素抵抗的影响

10周后，高脂组裸鼠的FBG、FINS和HOMA-IR均明显高于普食组［（4.92±0.67）mmol/L vs（3.67±0.66） mmol/L，t=4.209，P=0.001；（24.03±3.28） mU/L vs（18.98±1.75）mU/L，t=4.296，P=0.001；5.28±1.16 vs 3.10±0.68，t=5.127，P＜0.001］。腹腔注射葡萄糖 30 min、60 min、90 min、120 min后，高脂组裸鼠的血糖水平均明显高于普食组（均P＜0.05），且在30 min时血糖达高峰，120 min后仍高于正常水平，血糖曲线下面积（AUC）大于普食组（t=11.401，P＜0.001），见图 2A；腹腔注射胰岛素 30 min、60 min、90 min、120 min 后，高脂组的血糖水平均明显高于普食组（均P＜0.01），60 min时血糖水平较空腹时下降17.7%，普食组血糖则下降了30.7%，AUC亦大于普食组（t=12.468，P＜0.01），见图2B。

图2 高脂组和普食组裸鼠的胰岛素抵抗情况Fig.2 Insulin resistance in nude mice of high-fat diet group and the normal diet group

2.3 脂联素对裸鼠移植瘤生长的影响

脂联素处理后，HFD+APN组和ND+APN组荷瘤裸鼠移植瘤平均瘤体质量和体积增长速度均低于相应对照组，差异有统计学意义（均P＜0.05），见图3。

2.4 脂联素对荷瘤裸鼠糖代谢相关指标的影响

14周后，HFD组和HFD+APN组荷瘤裸鼠的FINS、HOMA-IR、TC和TG均较ND组和ND+APN明显升高（均 P＜0.01），且 HFD组高于HFD+APN组（均P＜0.01），而ND组和ND+APN组比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。HFD+APN组和HFD组的血脂联素水平均低于其相应对照组（AD+APN组和ND组），差异均有统计学意义（P＜0.01），见表4。

3 讨论

子宫内膜癌是女性常见的恶性肿瘤之一，流行病学数据显示肥胖、高血压、糖尿病是诱发子宫内膜癌的高危因素［7-8］。一项针对早期子宫内膜癌患者进行的回顾性研究中，与身体质量指数（BMI）＜40 kg/m2的患者相比，病态肥胖（BMI≥40 kg/m2）患者的生存期明显缩短，其中67%死于肥胖相关的非癌症疾病［9］。肥胖诱发癌症的机制主要有以下方面［10-11］：⑴改变相关脂肪因子的表达量；⑵引起胰岛素抵抗；⑶产生大量炎性因子，诱导慢性低度炎症状态；⑷脂肪细胞增生、肥大，导致缺氧，加重炎症状态；⑸为肿瘤细胞增殖提供能量。研究发现高脂饮食可以导致肥胖、高血糖、高胰岛素血症和胰岛素抵抗［12-13］，促进肿瘤的发生发展［14］。BANDERA 等［15］报道子宫内膜癌发生风险增加可能与总脂肪、饱和脂肪和动物脂肪摄入有关。由此推测高脂饮食、肥胖导致的机体脂肪细胞因子分泌异常、胰岛素抵抗可能与子宫内膜癌的发生发展有着密切的联系。本研究分别采用脂肪供能占45.0%的高脂饲料和脂肪供能占12.9%的普通饲料喂养裸鼠10周，发现高脂组裸鼠的平均体重、体长和HOMA-IR均明显大于普食组，随后在胰岛素抵抗裸鼠中皮下接种子宫内膜癌HEC-1B细胞，5 d后均可触及肿物，且高脂组裸鼠移植瘤体积及质量均高于普食组，说明本研究成功构建了胰岛素抵抗及子宫内膜癌移植瘤双重动物模型，且高脂饮食可诱导裸鼠糖耐量受损及胰岛素抵抗，进而促进子宫内膜癌HEC-1B细胞生长，与上述文献报道一致。

表4 14周后各组荷瘤裸鼠糖代谢相关指标水平Tab.4 Metabolic indicators of nude mice with endometrial cancer in each group after feeding 14 weeks

脂联素是脂肪细胞所分泌的若干细胞因子中含量最高的，浓度为3～30 μg/mL，约占血浆蛋白总量的0.01%［16］。脂联素可直接通过抑制促血管生成因子或间接通过改善胰岛素抵抗和炎症反应从而影响肿瘤细胞增殖［17］。有研究发现，胰岛素抵抗小鼠可降低脂联素受体的表达及脂联素敏感性［5］，而低脂联素水平会增加子宫内膜癌的发病风险［17］。为进一探讨脂联素对子宫内膜癌的影响，本研究在荷瘤裸鼠瘤体长至0.5 cm时腹腔注射脂联素，结果ND+APN组和HFD+APN组的移植瘤体质量和体积增长速度均明显低于相应对照组，进一步比较各组中的血脂联素水平发现，具有胰岛素抵抗的荷瘤裸鼠血脂联素水平较无胰岛素抵裸鼠显著降低，与上述文献报道一致，提示脂联素对子宫内膜癌移植瘤生长具有抑制作用。此外，与HFD组比较，HFD+APN组荷瘤裸鼠空腹血清胰岛素、胰岛素抵抗指数、血胆固醇和血甘油三酯的水平均下降，说明脂联素可能通过改善裸鼠胰岛素抵抗，从发挥更好的抑瘤作用。

综上所述，本研究成功构建胰岛素抵抗及子宫内膜癌移植瘤双重动物模型，脂联素可改善高脂饮食导致的糖脂代谢紊乱及胰岛素抵抗，从而抑制子宫内膜癌移植瘤生长。因此，进一步深入研究胰岛素抵抗促进子宫内膜癌发生发展机制，纠正与改善胰岛素抵抗，提高循环脂联素水平，可能成为临床防治子宫内膜癌的新途径。