微小RNA-130b在嘌呤霉素氨基核苷诱导的足细胞损伤中的作用及机制

王万鹏 蒯巧林 唐伯玉 王维 梁森林 潘艳 高甄典 李娟

223400 淮安，南京医科大学康达学院附属涟水县人民医院肾脏科(王万鹏，蒯巧林，唐伯玉，梁森林，高甄典，李娟)，检验科(王维，潘艳)

慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)是一个世界性的公共卫生与健康问题[1]。越来越多的基础及临床研究表明，无论原发病如何，蛋白尿均可加速CKD的进展。因此蛋白尿是CKD防治工作中重要的靶点，减少蛋白尿的发生发展将有助于延缓CKD的进展，改善患者预后。足细胞损害是引起肾小球性蛋白尿重要的病理因素，与多种肾小球疾病的发生发展关系密切。临床常见的原发性或继发性CKD，均伴有不同程度的足细胞损伤。因此，有关足细胞保护的研究在各型CKD的防治工作中都显得尤为重要，是CKD早期防治工作的重点[2]。

我们前期的研究中通过芯片筛查证实狼疮性肾炎(lupus nephritis，LN)患者中存在miRNA表达异常，扩大样本验证后发现异常升高的miR-130b与患者24 h尿蛋白定量呈正相关性[3]，但miR-130b在足细胞损伤中的作用尚不明确。本研究中，我们通过嘌呤霉素氨基核苷(puromycin aminonucleoside，PAN)诱导足细胞体外损伤模型，并使用微小RNA抑制剂(inhibitor)观察miR-130b在足细胞损害中的作用以及机制。

材料和方法

一、实验材料

主要试剂PAN购自美国Sigma，异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鬼笔环肽(上海翊圣生物科技有限公司)，RPMI-1640细胞培养液(美国Gibco公司)。miRNA提取试剂盒、miRNA反转录试剂盒、miRNA实时定量PCR试剂盒、Lipofectamine RNAiMax和Lipofectamine 2000转染试剂、MiR-130b和内参U6特异性探针引物(美国Life Technologies)；MiR-130b抑制剂和模拟物(mimic/inhibitor)及各自对照(NC)(广州瑞博生物有限公司)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒和Psicheck-2载体(美国Promega)；过氧化物增殖受体协同因子1(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α，PGC1α)多克隆抗体、突触足蛋白抗体(Synaptopodin)多克隆抗体(美国Proteintech)，肾病蛋白(Nephrin)单克隆抗体(美国abcame)，GAPDH抗体(美国CST)。胎牛血清(FBS)、RIPA裂解液、PMSF、BCA试剂盒、PVDF膜及ECL超敏发光剂(上海碧云天)。条件永生化温度敏感小鼠足细胞系MPC5由东南大学附属中大医院张光远博士馈赠，本实验室长期保存。

二、方法

1.足细胞培养、转染及分组 足细胞用含10%FBS的RPMI-1640培养液，先于33 ℃、10 μg/mL的重组小鼠γ干扰素诱导下增殖，待其长至约70%～80%融合时，使用0.05%胰蛋白酶消化细胞后传代并置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱内10～14 d使其分化成熟。按照Lipofectamine RNAiMax转染说明书进行转染：分化成熟的足细胞转染前更换Opti-MEM培养基，按照说明书分别配置A、B液及转染相应的miR-130b inhibitor或对照(NC)inhibitor(50 nM)。转染6 h后换正常培养基继续培养。实验主要分组：(1)PAN组：转染NC inhibitor 6 h后予以溶于二甲基亚砜(DMSO)的PAN(100 μg/mL)干预24 h；(2)PAN+miR-130b inhibitor组：转染miR-130b inhibitor 6 h后予以PAN干预24 h；(3)DMSO(对照)组：予以等量DMSO干预。

2.实时定量PCR MiRNA提取步骤按照试剂盒说明书，将总RNA产物溶解于无RNA酶水中。以RNA作为模板，按照反转录试剂盒说明书进行反转录成cDNA，反应体系5 μL，条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。实时定量PCR体系10 μL，反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40个循环。2610318N02Rik实时定量PCR，反转录条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。实时定量PCR体系10 μL，引物由上海生工合成，RIK序列为：正5’-CGCCTACCTGGATCTTCCAC-3’，反5’-CCAGACATGGGCTCACCAAT-3’，反应条件同上。其中miR-130b检测是用U6作为内参，RIK基因表达使用GAPDH作为内参。根据所得CT值，运用2-ΔΔCT相对定量法分别计算目的基因相对表达量。每个样本做3个复孔，取平均值。

3.足细胞骨架染色 按照试剂盒说明书使用PBS配置鬼笔环肽工作液(100 nM)，吸掉培养液，37 ℃预热的PBS清洗细胞2次，0.5% Triton X-100溶液透化处理5 min，FITC标记的鬼笔环肽工作液温避光孵育30 min，含有DAPI的抗荧光淬灭封片剂封片，激光共聚焦显微镜下进行荧光观察。

4.蛋白免疫印迹(Western blot)检测 弃去细胞培养基，PBS漂洗3次，加入200 μL含1% PMSF的细胞裂解液，刮取所有细胞，室温12 000 rpm离心15 min，进行蛋白浓度定量并配成统一浓度。加入1/4体积5×上样缓冲液，沸水中加热10 min。以稳定电压100 V转膜100 min，分别加入各种一抗，4 ℃过夜，PBST漂洗15 min，重复3次。加入HRP标记的相应二抗，37 ℃孵育60 min，PBST漂洗3次后用超敏ECL发光液进行化学发光检测，最后用凝胶成像分析系统拍照。

5.足细胞凋亡检测 用胰酶消化足细胞后离心，收集。冷PBS漂洗3次，1 000 g、4 ℃离心5 min。按照Annexin V/PI试剂盒说明书进行操作，重悬细胞，加入5 μL FITC标记的膜联蛋白V(FITC-Annexin V)和5 μL碘化丙啶(PI)混匀，室温避光20 min，使用300目的过滤网过滤后，立即用流式细胞仪检测，细胞分为4个象限：左下象限为活细胞，右下象限为早期凋亡细胞，右上象限为晚期凋亡和死亡细胞，左上象限为机械损伤细胞。

6.靶基因验证 通过生物信息学网站targetscan 7.2在线预测出miR-130b与PGC1α mRNA的3端非编码区(3’UTR)之间存在保守的结合位点。构建PGC1α 3’UTR野生型(wt-PGC1α-3’UTR)及结合位点突变型载体(mut-PGC1α-3’UTR)，分别将miR-130b mimic及其对照物NC mimic与各载体共转染足细胞。本部分实验共分4组：(1)NC mimic+mut-PGC1α-3’UTR组；(2)NC mimic+wt-PGC1α-3’UTR组；(3)miR-130b mimic+wt-PGC1α-3’UTR组；(4)miR-130b mimic+mut-PGC1α-3’UTR组。24 h后收集细胞，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒操作说明，检测细胞中萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性，以海肾荧光素酶活性为内参，计算相对萤火虫荧光素酶活性。

三、统计学处理

结 果

一、嘌呤霉素氨基核苷对PGC1α、miR-130b及宿主基因2610318N02Rik(RIK)表达的影响

如图1所示，随着PAN干预的浓度增加，足细胞内PGC1α蛋白表达减少(图1A)；而miR-130b表达上升，其中50 μg/mL与100 μg/mL组与对照组相比，差异均有意义(P<0.05，图1B)。同时，相似的表达趋势也见于宿主基因RIK(P<0.05，图1C)。

二、抑制miR-130b对于足细胞裂孔膜蛋白及PGC1α表达的影响

如图2所示，与对照组相比，PAN组的足细胞裂孔膜蛋白(synaptopodin和nephrin)及潜在靶基因(PGC1α)的表达明显降低(P<0.05)；而转染miR-130b inhibitor足细胞组与单纯PAN干预组比较，synaptopodin、nephrin及PGC1α表达上升，差异具有统计学意义(P<0.05)。

三、抑制miR-130b对于足细胞骨架排列的影响

鬼笔环肽染色结果如图3所示，PAN组足细胞骨架出现紊乱、重组以及降解，并向边缘聚集；与PAN组相比，PAN+miR-130b inhibitor组的足细胞骨架紊乱明显好转，在细胞内部可见排列有序的足细胞骨架。

图1 嘌呤霉素氨基核苷对PGC1α、miR-130b及RIK表达的影响(A.PGC1α蛋白，B.miR-130b，C.RIK基因)；与对照组比较，aP<0.05

四、抑制miR-130b对于足细胞凋亡的影响

各组足细胞凋亡如图4所示，与对照组比较，PAN干预24 h后可诱导足细胞凋亡，差异具有统计学意义(0.78%±0.45% vs 23.67%±3.06%，P<0.01)。PAN+miR-130b inhibitor组与PAN组相比，细胞凋亡减少(23.67%±3.06% vs 15.47%±1.74%)，差异具有统计学意义(P=0.016)。

五、miR-130b对于足细胞PGC1α表达的影响

Western blot结果见图5A，与对照组比较，转染miR-130b mimic 24h后可以下调PGC1α的蛋白表达(P<0.05)。双荧光素酶报告基因检测结果见图5B，miR-130b mimic+wt-PGC1α-3’UTR组与NC mimic+wt-PGC1α-3’UTR组比较，荧光强度明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；而miR-130b mimic+mut-PGC1α-3’UTR组与NC mimic+mut-PGC1α-3’UTR组比较，荧光强度差异无统计学意义(P>0.05)。

注：与DMSO组比较，aP<0.05；与PAN+miR-130b inhibitor组比较，bP<0.05图2 抑制miR-130b对于足细胞裂孔膜蛋白表达的影响

图3 抑制miR-130b对于足细胞骨架排列的影响

注：与DMSO组比较，aP<0.05；与PAN+NC inhibitor组比较，bP<0.05图4 miR-130b对于足细胞凋亡的影响

讨 论

足细胞损伤机制极其复杂，多种理化、生物因素均可影响足细胞的功能。近年来，随着表观遗传学的研究深入，表观遗传缺陷在足细胞损害中的作用也越来越受到学界关注。PAN是嘌呤霉素的衍生物，具有选择性的肾损害作用，PAN所致的肾脏损伤与人类肾病损伤一致，早期表现为细胞足突融合和消失的微小病变，随着PAN作用时间的延长和蓄积量的增加，足细胞凋亡增加，进一步发展为局灶节段性肾小球硬化。而PAN作用的靶细胞即为足细胞，在本研究中我们发现PAN干预后足细胞裂孔膜蛋白表达降低、骨架重排降解、凋亡增加。而伴随PAN作用浓度的提高，我们也发现足细胞内miR-130b表达升高，这个结果初步提示miR-130b可能参与了PAN诱导的足细胞损伤。而宿主基因RIK的表达也被证实伴随上升(图1C)，这个结果提示，PAN可能可以直接促进RIK的转录而上调miR-130b的表达。但具体机制尚不明了，在未来的研究中我们将继续深入。

图5 PGC1α是miR-130b的靶基因(A.miR-130b对于足细胞PGC1α蛋白表达的影响，与转染NC mimic组比较，aP<0.05；B.双荧光素酶报告基因系统检测miR-130b与PGC1α靶向关系，与其余3组比较，aP<0.05)

目前尚无关于miR-130b与足细胞损伤相关的报道。已知的miR-130b的功能主要集中在肿瘤生物行为学、代谢性疾病及衰老的相关性研究。我们注意到Wang等[4]的研究结果显示肥胖小鼠模型和中国人中循环miR-130b水平升高，且与身体质量指数呈正相关，与三酰甘油水平相比，是代谢综合征的一个更好的预测因子；进一步研究显示这些升高的miR-130b能以肌细胞作为靶点，降低肌细胞靶基因PGC1α表达，在肌肉脂肪氧化中起关键作用。我们前期的研究也发现，miR-130b可以通过抑制肾小管上皮细胞内的过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)而参与肾脏纤维化的进展[5]。在本研究中，我们也证实，随着PAN作用浓度增加，PGC1α在足细胞的中的表达也进一步降低(图1A)，提示升高的miR-130b可能参与了对于PGC1α的调节。

PGC1α与PPARγ都是重要的肾脏保护因子，并影响机体与细胞多种生命活动，包括诱导肿瘤细胞分化和凋亡、抗炎反应、调控脂肪、糖代谢、能量平衡，抑制肿瘤血管生成、抗肝纤维化作用、抗动脉粥样硬化、降血脂和降血压、改善心功能衰竭等[6-7]。在CKD的研究中，人们发现PPARγ激动剂能够降低醛固酮诱导的高血压大鼠模型肾脏中ET-1、COX-2及TGF-β1的过表达，发挥抗炎、抗纤维化的作用[8]。相似的肾脏保护作用也被证实存在于小鼠肾缺血/再灌注损伤的模型中[9]。而激活PGC1α也被证明可以减少高糖环境下引起的足细胞骨架排列紊乱、表达减少，进一步研究显示主要通过抑制线粒体自由基合成，改善呼吸链复合物活性，提高线粒体膜电位，抑制线粒体凋亡通路的激活[10]。在本研究中结果显示抑制miR-130b表达可以有效缓解PAN诱导足细胞裂孔膜蛋白下降、细胞骨架重排及凋亡发生率，并同时提高PGC1α表达。进一步通过Western blot及双荧光素报告酶系统检测证实miR-130b在足细胞损伤中的作用可能与其可以抑制PGC1α表达相关。

综上所述，miR-130b可能通过靶向抑制PGC1α表达进而参与足细胞的损伤，而抑制miR-130b的表达对足细胞保护具有积极意义。