《蒲公英多糖铁的制备及其铁含量测定》综合创新实验设计

樊永婵，李炳川，李沫瑶，张莲姬,2

(1 延边大学理学院化学系，吉林 延吉 133002；2 延边大学化学国家级实验教学示范中心，吉林 延吉 133002)

目前各个高校在高年级开设综合性实验课程，其目的是培养学生探究精神、创新思维。但现状不容乐观，其存在的问题主要有以下几点：(1)实验中学生能够自主设计与探索的部分较少。从实验原理、实验步骤到思考与讨论，都是预先设定的，学生没有自主探索的机会。(2)实验项目内容比较陈旧，不利于激发学生的实验兴趣和积极性。(3)学生很少有综合运用实验知识、技能的机会，很容易感知到所掌握的知识和技能是“短截性”的，面对实际课题仍无从下手。因此，有必要设计能避免以上现存问题的创新性综合实验，提高学生的创新能力、综合运用知识的能力及分析问题和解决问题能力等。

多糖铁配合物(PIC)是一种新型补铁剂[1]，具有良好的疗效、稳定性、生物活性，近几年许多学者致力研发新型补铁剂，如当归多糖铁、大枣多糖铁等[2]，但目前将关于多糖铁的科研成果设计为本科生综合实验项目的尚未见报道。

本创新实验题目来源于一项大学生创新创业科研项目，选用各地区均广泛存在的蒲公英为材料，制备一种新型口服补铁剂。实验内容包括多糖的提取及精制、多糖铁的制备和铁含量测定[3]，在整个实验过程中综合运用了学生所掌握的基本知识和技能，让学生感知到学而有用。

本创新实验设计尝试将大学生创新创业课题成果与实验教学相结合[4]，为深化化学实验教学改革，提高实验教学中综合性、创新性，培养高素质专业创新人才提供有效途径。

1 实 验

1.1 实验原理

铁是维持人体主要代谢功能所必需的生命元素，缺铁会引起缺铁性贫血及其他疾病。口服补铁剂是治疗缺铁性贫血的最有效的方法。传统补铁剂如硫酸亚铁，存在刺激胃肠道和稳定性差的缺点。新型多糖铁补铁剂(PIC)，不仅稳定性良好，在体内释放铁后，多糖还具有多种生物活性。

蒲公英的花、叶、根中都含有多糖，其中根部多糖含量最高。据报道蒲公英多糖具有抗菌、抗氧化、等生理活性[5]，是优良的多糖的提取材料。多糖易溶于热水，不溶于乙醇等有机溶剂，因此本实验采用水提醇沉法提取蒲公英根粗多糖，采用Sevag法除蛋白，获得蒲公英精多糖；以蒲公英精多糖和氯化铁为反应物，在碱性条件下制备蒲公英多糖铁，采用透析法精制。

多糖铁的结构研究表明，三价铁(如FeCl3)在碱性条件下由于其内在特性易形成羟基氧化铁聚合铁核，然后以聚合铁核为结构中心，稳定地螯合一层多糖链，形成铁核分子，外部再包裹一层亲水性的鞘状多糖链，图1为多糖铁结构示意图。

图1 多糖铁结构示意图

1.2 试剂或材料

氯化铁、柠檬酸三钠、盐酸羟胺、邻二氮菲、醋酸钠、无水乙醇、石油醚、硫氰酸钾，以上试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；蒲公英根，吉林省长白山地区的野生蒲公英根；透析袋(截留分子质量7000 D)，上海源叶生物科技有限公司。

1.3 仪器和表征方法

1.3.1 仪 器

HH-2数显恒温水浴锅，江苏省金坛市科析仪器有限公司；TU-1901 双光束紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；80-2台式离心机，江苏省金坛市科析仪器有限公司；KQ-300DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；98-1-C型数字控温电热套，天津市泰斯特仪器有限公司；RT2基本型加热搅拌器，上海珂淮仪器有限公司；WD700 LG微波炉，天津乐金电器有限公司。

1.3.2 表征方法

紫外-可见分光光度法。

1.4 实验步骤/方法

1.4.1 蒲公英多糖的提取及精制

1.4.1.1 脱脂处理

称取2 g干燥至恒重、粉碎、过60目筛的蒲公英根粉，用回流装置和石油醚，脱脂处理1 h后，挥干溶剂。

1.4.1.2 粗多糖的提取

本步骤中，引导学生采用粗多糖的提取中常用的普通热水提取法、微波辅助法、超声波辅助法进行探索。探索实验内容如下：

(1)普通热水提取法：向干燥的蒲公英粉中加60 mL去离子水，80 ℃水浴浸提2 h，过滤，弃渣，取滤液。

(2)微波辅助法：微波分次处理干燥的蒲公英粉2 min (功率为420 W)，加60 mL去离子水，80 ℃水浴浸提2 h，过滤，弃渣，取滤液。

(3)超声波辅助法：向干燥的蒲公英粉中加60 mL去离子水，超声振荡1 h(120 W，60 ℃)，过滤，弃渣，取滤液。

1.4.1.3 粗多糖的精制及得率计算

采用Sevag法除蛋白，具体操作如下：将蒲公英多糖溶液倒入分液漏斗中，加入其体积1/4的Sevag溶液(氯仿:正丁醇体积比为4:1)，剧烈振荡、静置，将浑浊的蛋白层从分液漏斗下口放出，重复操作直至没有浑浊的蛋白层。将多糖液从分液漏斗上口倒入烧杯中，80 ℃加热浓缩至约其体积1/3，冷却，加入其体积3倍的无水乙醇，于4 ℃冰箱一夜。离心(3000 rpm，10 min)，取沉淀、干燥，获得蒲公英精多糖，称重并计算得率。

1.4.2 蒲公英多糖铁的制备及精制

1.4.2.1 多糖铁的制备

采用FeCl3共热法制备蒲公英多糖铁，具体操作如下：称取0.2 g蒲公英精多糖和0.1 g柠檬酸三钠置于三口烧瓶中，60 ℃加热溶解。在磁力搅拌条件下缓慢滴加2 mol·L-1的FeCl3和20% NaOH(滴加速度比约1:2)，反应过程中用精密pH试纸检查反应液的pH，控制pH为8，当出现红棕色沉淀时立即停止滴加，继续反应1 h。

本步骤中，引导学生对制备多糖铁的不同条件如：温度、pH进行探索。

探索实验内容如下：

(1)反应温度分别设定为50、60、70 ℃，其他步骤同上。

(2)反应液pH控制为7、8、9，其他步骤同上。

1.4.2.2 多糖铁的精制

采用透析法精制。将上一步反应液冷却后倒入透析袋中，用去离子水透析，约4 h后换水，继续透析一夜。

1.4.3 蒲公英多糖铁中铁含量的测定

1.4.3.1 蒲公英多糖铁样品溶液的配制及稳定性实验

将透析袋中的溶液离心，上清液转移至100 mL容量瓶中，透析袋用去离子水洗三次，洗液全部加入容量瓶中，定容。取5 mL样品溶液，加1 mL 10%硫氰酸钾，观察溶液是否变为血红色。

1.4.3.2 最佳吸收波长的确定

准确移取10 μg·mL-1铁标准溶液5 mL于50 mL容量瓶中，加入1 mL 10% 盐酸羟胺溶液，摇匀。放置2 min后，加5 mL 0.1 mol·L-1NaAc溶液和2 mL 0.15%邻二氮菲溶液，定容，显色30 min。配制10 μg·mL-1多糖铁溶液，按同样方法定容，显色30 min。用1 cm比色皿，以空白试剂为参比液，在400～ 600 nm波长范围内对两种溶液进行扫描，确定λmax。

1.4.3.3 绘制铁标准曲线，计算多糖铁中的铁含量

准备7支50 mL容量瓶，1～6号分别加入0.00，2.00，4.00，6.00，8.00，10.00 mL 铁标准溶液，7号加入5 mL多糖铁样品溶液，其后再分别加入盐酸羟胺溶液，摇匀，放置2 min，再各加入5 mL NaAc溶液和2 mL 邻二氮菲溶液，定容，显色30 min，在λmax处，测定各溶液的吸光度A。

2 结果与讨论

2.1 多糖的提取

普通热水提取法是通过扩散作用将多糖从蒲公英根部组织内溶解出来，由于细胞内外达到动态平衡需要较长时间，短时间内多糖不能完全溶出，结合教学时数，将热水浸提时间确定为2 h，精多糖得率为10.01%。

表1 不同方法提取的精多糖得率

微波辅助法中使用的微波能是一种能量形式[6]，它能使极性物质组成的分子瞬时极化相互碰撞促进反应。在提取时间相同条件下，提取多糖时首先微波处理再热水提取，得率为11.23%，与热水浸提相比得率提高11.29%。

超声波辅助提取法是利用超声波的空化效应将细胞壁震碎[7]。不仅缩短了提取时间，而且多糖得率为15.22%，比热水提取法得率提高52.05%。

在此步骤中，还可以引导学生通过文献的索引，了解其他的多糖提取方法，如酶解法[8]、微波-超声联合法等，拓展相关的知识面。

2.2 多糖铁的制备

表2 不同条件制备的多糖铁铁含量

温度较高时，多糖分子无规则运动速率加快使反应受阻；温度较低时，多糖与Fe3+络合速率降低。故选择60 ℃为最佳反应温度。

反应液pH对多糖铁中铁含量的影响较大。柠檬酸三钠作为反应的螯合剂[9]，水溶液呈弱碱性。pH为7时，其促络合能力下降，Fe3+不能与多糖完全结合；pH为9时，多糖的部分结构可能被破坏，同时反应液中离子强度增强，产生的阴离子与多糖分子的活性基团发生竞争作用阻碍配合物的形成[10]。故选择最佳反应液pH为8。

在此步骤中，设置讨论问题：除了本实验中探索的因素之外，还有哪些因素会影响实验结果？引导学生掌握确定最佳实验条件的方法，如单因素试验、正交试验、响应面试验等，进一步拓展学生的知识面。

2.3 多糖铁中铁含量测定

2.3.1 绘制铁标准溶液和多糖铁溶液的吸收光谱

比较铁标准溶液和多糖铁溶液的吸收曲线，确定最佳吸收波长为510 nm。

图2 铁标准溶液和多糖铁溶液的吸收光谱

2.3.2 铁标准曲线的绘制

图3 铁标准曲线

实验结果表明，在0～2.0 μg·mL-1浓度范围内，吸光度与浓度线性关系良好。

2.3.3 蒲公英多糖铁中铁含量的测定

表3 铁含量测定结果

根据回归方程，计算出7号溶液浓度为0.82 μg·mL-1，由稀释比例可知，样品溶液的铁含量为8.2 μg·mL-1。

3 结 语

本综合创新实验，实验内容涵盖到有机化学、分析化学、无机化学等领域，有助于提高学生综合运用知识的能力。将科研成果融合到实验教学中，能够开拓学生视野，提高实验兴趣。在多糖提取、多糖铁的制备中增加探索实验条件的环节，使整个教学过程充满科学探究的乐趣。通过对实验结果的分析，激发探究问题、解决问题的积极性。该实验难度适中、内容充实、现象稳定、重复性好，适用于化学及其相关专业本科生综合实验教学。