胃癌组织中HOXC10表达与临床病理特征及预后关系的研究

李竟长 罗运生 张志红 李 敏 卫青青 黄 成 石 周 黄文强 倪秉强

胃癌是较常见的恶性肿瘤，目前全球范围内胃癌病死率居第2位，胃癌的早期诊断较为困难，发现时多处于进展期，预后较差[1-2]。尽管目前化学治疗、放射治疗和手术等的改进能明显延长胃癌患者的总生存期(OS)，但其5年生存率仍很低[3]。因此，寻找能预测胃癌患者预后的生物学标志物，对于临床诊治及提供治疗决策依据非常重要。

HOXC10是HOX基因家族成员，其在机体生长发育、细胞分化、增殖、凋亡及受体信号转导等调节中起着重要作用。研究表明HOXC10的异常上调可能参与了包括胃癌在内的多种肿瘤的发生、发展[4-6]。胃癌组织中HOXC10的表达水平与患者临床病理特征及预后之间的关系尚未明确，本文就此进行研究，探讨HOXC10作为预后预测指标的临床价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2010年1月至2012年12月在柳州市人民医院接受胃癌根治术的264例患者，以及2017年1月至2017年6月接受胃癌根治术的20例患者的新鲜胃癌组织及相应癌旁正常组织(距肿瘤边缘>2 cm)。所有患者均经病理检查确诊为胃腺癌，术前均未接受化学治疗和放射治疗，统一根据国际抗癌联盟(UICC)第八版TNM分期标准进行分期，依据美国国立综合癌症网络(NCCN)胃癌诊治实践指南进行术后辅助治疗。所有患者知情并签署由医院伦理委员会批准的知情同意书。

1.2 RNA提取和实时荧光定量PCR检测

按照Trizol法提取胃癌组织及癌旁组织的总RNA，用核酸蛋白检测仪对RNA的浓度和纯度进行测定；按照逆转录反应体系要求进行qRT-PCR，所用的HOXC10、人β-actin内参引物见表1。HOXC10 mRNA相对于人β-actin表达量的计算方法为2-ΔCt(ΔCt=癌组织或癌旁组织中HOXC10的Ct值-相同样本中人β-actin的Ct值)。HOXC10 mRNA在胃癌组织与癌旁组织中的相对表达量的计算方法为：2-ΔΔCt(ΔΔCt=ΔCt癌组织-ΔCt癌旁组织)。根据胃癌组织相对癌旁组织的HOXC10表达水平将样本分成2组，<1为低表达组，≥1为高表达组。

表1 引物序列

1.3 免疫组织化学检测

用4%福尔马林固定组织，然后用石蜡包埋切片(厚度4 μm)。脱蜡后，切片用3% H2O2封闭内源性过氧化物酶，加入10 mL(pH 6.0)枸橼酸钠缓冲液中，92 °C～95 °C加热15 min，进行抗原修复。用5% BSA封闭非特异性抗原，将用5% BSA 1∶100稀释的兔抗人HOXC10单克隆抗体加到玻片上，完全覆盖组织，4 °C冰箱孵育过夜，PBS漂洗2次(5 min)。将二抗(山羊抗兔)加到玻片上，完全覆盖组织，37 °C湿盒孵育40 min，PBS漂洗2次(5 min)。用DAB显色，显微镜观察，反应时间控制在2～4 min，自来水冲洗终止显示。用苏木素室温复染30 min，自来水冲洗返蓝，梯度乙醇溶液脱水，二甲苯透明，中性树胶封片后于显微镜下观察。

1.4 随访情况

本研究随访终点为随访时间满5年或患者死亡。无复发生存期(RFS)定义为从患者接受手术开始到出现肿瘤复发、进展或因各种原因导致死亡的时间。OS定义为从患者接受手术开始至因任何原因导致死亡之日或随访结束之日的时间。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 7软件进行数据分析和作图。采用配对t检验分析胃癌组织与癌旁组织中HOXC10的表达差异，采用χ2检验分析临床病理特征与HOXC10相对表达水平的关系。采用Kaplan-Meier方法分析HOXC10表达水平与RFS、OS的关系。采用Cox回归分析单因素、多因素与RFS、OS的关系。用二元Logistic回归分析建立Logistic回归模型。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌及癌旁组织中HOXC10 mRNA表达情况

结果显示， HOXC10 mRNA在胃癌组织中表达较癌旁组织显著上调(图1)，差异有统计学意义(P<0.05)。HOXC10 mRNA在胃高分化腺癌(Ⅰ级)、中分化腺癌(Ⅱ级)中低表达，在胃低分化腺癌(Ⅲ级)中高表达(图2)，差异有统计学意义(P<0.05)。

注：与胃癌组织相比，**P<0.05

图1 HOXC10 mRNA在胃癌组织及癌旁组织中的表达

图2 HOXC10 mRNA在胃癌组织中的表达水平 DAB染色 ×100 A 高分化腺癌 B 中分化腺癌 C 低分化腺癌

2.2 HOXC10表达水平与患者临床病理特征的相关性分析

本研究共纳入264例胃癌患者，其临床病理特征数据见表2。HOXC10表达水平与患者性别及年龄不明显相关(P>0.05)。HOXC10表达水平与患者病理分级、Lauren分型、TNM分期、肿瘤浸润深度(T分期)及淋巴结转移数量(N分期)等临床病理特征明显相关，HOXC10在病理分级差、弥漫型、TNM分期晚、肿瘤浸润深、淋巴结转移多的患者中高表达(P<0.05)。

2.3 HOXC10表达水平与预后的关系

根据HOXC10表达水平将样本分为高表达组和低表达组，进行Kaplan-Meier生存分析，两组比较结果显示，HOXC10低表达组的RFS和OS均长于高表达组，差异均有统计学意义(P均<0.001)。见图3。

2.4 临床病理特征及HOXC10表达水平与预后的Cox回归分析

单因素Cox回归分析显示，病理分级、Lauren分型、TNM分期、T分期、N分期及HOXC10表达水平与RFS及OS均显著相关(P<0.05)，而性别和年龄与RFS和OS无显著相关性(P>0.05)。剔除性别、年龄后，进一步进行多因素Cox回归分析，发现病理分级、Lauren分型、TNM分期、T分期、N分期及HOXC10 表达水平与胃癌患者的RFS及OS均显著相关(P<0.05)。见表3、表4。

表2 HOXC10表达水平与胃癌患者临床病理特征的关系/例

图3 HOXC10低表达组与高表达组的RFS曲线及OS曲线 A RFS曲线 B OS曲线

表3 临床病理特征及HOXC10表达水平与RFS的Cox回归分析

表4 临床病理特征及HOXC10表达水平与OS的Cox回归分析

2.5 Logistic回归模型

根据Cox多因素风险回归模型分析结果，将与胃癌患者RFS及OS有密切相关性的病理分级、Lauren分型、TNM分期、T分期、N分期及HOXC10表达水平6个变量纳入Logistic回归模型。再根据Logistic回归分析结果，纳入病理分级、Lauren分型、TNM分期、T分期和N分期5个变量作为基于传统临床病理特征参数预测胃癌患者5年内复发或死亡风险。然后再纳入病理分级、Lauren分型、TNM分期、T分期和HOXC10表达水平5个变量作为基于HOXC10表达水平预测胃癌患者5年内复发或死亡风险，基于两组参数平行原则，未纳入N分期作为参数。基于传统临床病理特征参数预测的胃癌患者5年内复发风险模型受试者工作特征(ROC)曲线下面积(0.844，95%CI：0.790～0.898)与基于HOXC10参数预测的胃癌患者5年内复发风险模型的ROC曲线下面积(0.841，95%CI：0.787～0.895)比较，差异无统计学意义(P>0.05)。基于传统临床病理特征参数预测的胃癌患者5年内死亡风险模型的ROC曲线下面积(0.867，95%CI：0.815～0.919)与基于HOXC10参数预测的胃癌患者5年内死亡风险模型的曲线下面积(0.858，95%CI：0.804～0.912)比较，差异亦无统计学意义(P>0.05)。见图4。

图4 两类预测胃癌5年内复发或死亡风险模型的ROC曲线 A 基于临床病理特征和HOXC10表达的5年内胃癌复发预测模型的ROC曲线 B 基于临床病理特征和HOXC10表达水平的5年内胃癌死亡预测模型的ROC曲线

3 讨论

HOX基因编码的蛋白是负责调节细胞分化、增殖、凋亡及血管生成的转录因子[4]，除了在胚胎发育和组织重塑中的作用外，HOX基因网络也参与机体造血和白血病的发生、发展[5]。研究发现HOX基因在口腔鳞癌、食管癌、结直肠癌及胰腺癌中呈异常高表达，参与了肿瘤的发生、发展[6-9]。然而，目前对HOX基因表达与胃癌的关系仍知之甚少。

HOXC10是HOX基因家族的成员，由于其在肿瘤发展中的重要作用而受到越来越多的关注。目前研究表明，HOXC10在多种实体肿瘤中呈异常高表达，如乳腺癌[10]、脑胶质瘤[11]、宫颈癌[12]、甲状腺癌[13]等，且参与各种肿瘤的发生、发展过程。Guo等[14]的研究发现HOXC10在胃癌细胞中表达异常上调，促进了胃癌细胞增殖、侵袭和转移，机制研究表明其主要通过激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路促进胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移。Tang等[15]的研究发现HOXC10在肺腺癌中高表达，且其高表达与淋巴结转移、器官转移及TNM分期等临床病理特征密切相关，相对于HOXC10低表达者，HOXC10高表达者的RFS和OS更短，预后更差。

本研究对20对新鲜胃癌组织及癌旁组织进行RT-PCR检测，结果显示HOXC10在胃癌组织中的表达较癌旁组织显著上调。为了进一步明确HOXC10在胃癌组织中的表达情况，对264例术后胃癌组织标本进行免疫组织化学分析，结果显示HOXC10表达水平与病理分级(P=0.001)、Lauren分型(P=0.001)、TNM分期(P=0.007)、肿瘤浸润深度(P=0.044)及淋巴结转移数量(P=0.012)等临床病理特征明显相关，与性别及年龄无明显相关性(P>0.05)。Kaplan-Meier生存分析结果显示，HOXC10高表达者的RFS和OS均较低表达者短，预后更差。Cox回归分析发现病理分级、Lauren分型、TNM分期、T分期、N分期及HOXC10 表达水平与胃癌患者的RFS及OS均显著相关(P<0.05)。此外，Logistic回归模型分析结果显示，HOXC10高表达是胃癌的独立预测因子，基于HOXC10参数的Logistic回归模型与基于传统临床病理特征参数的Logistic回归模型对胃癌患者术后5年内复发或死亡风险的预测效果差异无统计学意义，说明两类预测模型效果相当。

综上所述，本研究结果表明胃癌组织中HOXC10的表达水平与患者临床病理特征及预后密切相关，HOXC10可能在胃癌的发生、发展及转移等过程中起着重要的促进作用，其可能成为预测胃癌患者预后、指导治疗的生物学指标。