慢病毒介导长链非编码RNA H19过表达对非酒精性脂肪性肝病大鼠的影响

姜 明 金 晶 沈红波 王 金 郑 杰 周一农

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是患者无过量饮酒史而肝细胞出现炎性反应、坏死或凋亡的一系列肝脏疾病[1-2]。NAFLD发生、发展的机制尚未明确，其对疾病的治疗具有重要意义[3]。Rabelo等[4]的研究表明，氧化应激调节因子还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶4((NOX4)与NAFLD的发生、发展相关。研究显示长链非编码RNA H19(lncRNA H19)过表达对肝功能及肝损伤具有保护作用[5]。然而，lncRNA H19是否可通过调节NOX4的表达改变NAFLD大鼠肝组织的氧化应激状态尚未可知。本研究探讨了lncRNA H19过表达对NAFLD大鼠肝损伤修复、脂质代谢调节以及肝功能改善的影响，并探究了lncRNA H19是否可通过调控NOX4来抑制大鼠NAFLD的发展。

1 材料与方法

1.1 实验动物

无特定病原体(SPF)级SD大鼠50只，雄性，(170±20)g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号SCXK(京)2018-0042。保持室温(22±3)℃，相对湿度(50±20)%，明暗交替各12 h，适应性饲养1周。自由饮水、进食。

1.2 主要试剂与仪器

试剂：胆酸钠(安徽科宝生物公司)，蛋黄粉(北京奥博星生物公司)，食用猪油(浙江金恩食品有限公司)，胆固醇(上海医药公司)，基础饲料(北京奥博星生物技术公司)，水合氯醛(天津福星公司)，丙氨酸氨基转移酶(ALT)酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒、天冬氨酸氨基转移酶(AST)ELISA试剂盒、三酰甘油(TG)ELISA试剂盒、总胆固醇(TC)ELISA试剂盒(上海碧云天公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、BCA蛋白定量测定试剂盒(上海碧云天公司)，RNA提取试剂盒，反转录试剂盒(美国Beyotime公司)、苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(北京索莱宝公司)、兔多克隆抗NOX4抗体(美国Abcam公司)，HRP标记山羊抗兔二抗(北京中杉金桥生物公司)，SDS-PAGE凝胶配置试剂盒(上海碧云天公司)，ECL发光试剂盒(美国Thermo公司)。

仪器：超声破碎仪(上海欧河公司)，垂直电泳槽(美国Bio-Rad公司)，稳压稳流电泳仪(北京六一公司)，聚合酶链反应(PCR)扩增仪(美国Bio-Rad公司)。由沈阳万类公司设计PCR引物，引物序列见表1。

表1 引物序列

注：TGF-β1为转化生长因子-β1，CTGF为结缔组织生长因子

1.3 动物模型制备与分组

参考文献进行大鼠NAFLD模型制备[6]。将50只大鼠随机分为对照组10只、高脂饲料组40只。对照组给予基础饲料饲养8周，高脂饲料组给予高脂饲料(70.5%基础饲料、20%食用猪油、7%蛋黄粉、2%胆固醇、0.5%胆酸钠猪油)饲养8周。从高脂饲料组40只大鼠中随机处死10只，取出肝脏制作病理切片，观察肝脏病理改变以判断是否造模成功。将造模成功的30只大鼠随机分为模型组、空载体组、过表达H19组；对照组大鼠继续给予基础饲料饲养4周，模型组、空载体组、过表达H19组大鼠给予高脂饲料饲养4周，其中空载体组大鼠在第9、10、11周第1天于尾静脉注射空载体200 μL，过表达H19组大鼠在相同时间点于尾静脉注射lncRNA H19慢病毒载体200 μL，4组大鼠在实验12周后全部处死。每只大鼠予测体质量并计算肝脏指数(肝脏指数=肝脏湿重/大鼠体质量×100%)。

1.4 ELISA法及生物化学法检测各组肝功能、血脂及氧化应激指标

实验第12周末，大鼠禁食12 h后测体质量。给予各组大鼠腹腔注射1 mL/kg戊巴比妥钠麻醉，剪开腹腔，于心脏取血5 mL，3 000 r/min，离心15 min。取上清，置于-20 ℃冰箱待用。将血清从冰箱中取出，用适量Assay Buffer稀释。用ELISA试剂盒检测各组血清ALT、AST、TC、TG水平。用生物化学试剂盒测定氧化应激指标。

1.5 HE染色观察各组肝组织病理变化

大鼠麻醉方法同上。剪开腹腔，用0.9%氯化钠溶液进行心脏灌流，排空大鼠体内血液，迅速取出肝组织，并从肝右小叶取黄豆大小的组织块，放入4 %多聚甲醛中固定24 h，再用乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片。组织切片经脱蜡，水化，HE染色，中性树胶封片，置于显微镜下观察。

1.6 RT-PCR法检测各组肝组织中NOX4 mRNA、TGF-β1 mRNA、CTGF mRNA表达水平

肝组织的采集方法同上，取出肝脏进行总RNA提取，使用Trizol法对研磨后的组织抽提RNA，利用紫外分光光度仪检测纯度。cDNA反转录合成阶段，取1 μg RNA，加入反应试剂，以终体积20 μL的体系进行cDNA合成，65 ℃ 15 min，43 ℃ 20 min，70 ℃ 15 min。RT-PCR扩增阶段，采用Bio-Rad PCR仪进行，94 ℃ 15 min，1个循环；95 ℃ 15 s，65 ℃ 1 min，45个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的RNA的相对表达量，内参是β-actin。

1.7 Western Blotting法检测各组肝组织中NOX4蛋白表达水平

裂解液裂解肝组织，低温离心30 min以提取总蛋白，BCA法计算样本总蛋白水平，加入适量上样缓冲液，沸水浴7 min使蛋白充分变性，电泳，完毕后转移到PVDF膜上。兔多克隆抗NOX4抗体(1∶200)4 ℃孵育过夜，HRP标记山羊抗兔IgG(1∶1 000)室温孵育1 h，ECL发光液避光显色。利用Image-pro plus 5.0软件进行条带扫描半定量，NOX4蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值×100%。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 各组的体质量、肝脏湿重与肝脏指数比较

模型组、空载体组、过表达H19组的体质量、肝脏湿重及肝脏指数均高于对照组，差异均有统计学意义(P均<0.05)。空载体组与模型组的体质量、肝脏湿重及肝脏指数差异无统计学意义(P<0.05)。与模型组、空载体组相比，过表达H19组的体质量、肝脏湿重及肝脏指数降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组的体质量、肝脏湿重及肝脏指数比较()

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与空载体组比较，cP<0.05

2.2 各组的血清ALT、AST、TC、TG水平比较

模型组、空载体组、过表达H19组的血清ALT、AST、TC、TG水平均高于对照组，差异均有统计学意义(P均<0.05)。空载体组与模型组的血清ALT、AST、TC、TG水平差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组、空载体组相比，过表达H19组的血清ALT、AST、TC、TG水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与空载体组比较，cP<0.05

图1各组血清ALT、AST、TC、TG水平比较AALTBASTCTCDTG

2.3 各组的肝脏病理学评估

光学显微镜下，对照组的肝小叶结构保持完整，肝索放射性分布，界板完整，中央静脉清晰可见，肝细胞几乎无脂肪变性，小叶内几乎无炎性反应，肝细胞也无气球样病变。模型组、空载体组的肝组织中脂滴增多，大泡形和小泡形均存在，明显可见气球样变，门管区出现炎性细胞，腺泡内可见点状肝细胞坏死，并有约50%的大鼠出现肝细胞纤维化。过表达H19组的肝细胞病变明显减少，可见小叶内部分汇管区炎性反应，点状肝细胞坏死，无气球样病变。见图2。

图2 各组的肝脏病理改变 HE染色 ×200 A 对照组 B 模型组 C 空载体组 D 过表达H19组

2.4 各组大鼠肝组织中SOD、GSH、MDA的水平比较

与对照组相比，模型组、空载体组的肝组织中SOD、GSH水平降低、MDA水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。空载体组与模型组的肝组织中SOD、GSH、MDA水平差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组、空载体组相比，过表达H19组的肝组织中SOD、GSH水平升高、MDA水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组的肝组织中SOD、GSH和MDA水平比较()

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与空载体组比较，cP<0.05

2.5 各组的肝组织中NOX4 mRNA、TGF-β1 mRNA及CTGF mRNA表达水平比较

与对照组相比，模型组、空载体组的肝组织中NOX4 mRNA、TGF-β1 mRNA及CTGF mRNA的表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。空载体组与模型组的肝组织中NOX4 mRNA、TGF-β1 mRNA及CTGF mRNA的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组、空载体组相比，过表达H19组肝组织中NOX4 mRNA、TGF-β1 mRNA及CTGF mRNA的表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠肝组织中NOX4 mRNA、TGF-β1 mRNA及CTGF mRNA的表达水平比较()

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与空载体组比较，cP<0.05

2.6 各组的肝组织中NOX4蛋白的表达水平比较

对照组、模型组、空载体组、过表达H19组的肝组织中NOX4蛋白相对表达量分别为(0.09±0.09)%、(0.33±0.12)%、(0.28±0.11)%、(0.15±0.09)%，差异有统计学意义(F=11.64，P<0.001)。与对照组比较，模型组、空载体组大鼠肝组织中NOX4蛋白表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。空载体组与模型组的肝组织中NOX4蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。过表达H19组的肝组织中NOX4蛋白表达水平低于模型组、空载体组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 各组肝组织中NOX4蛋白的表达水平比较

3 讨论

NAFLD主要是由TG在肝脏内过度贮积而引起的疾病。目前认为NAFLD的发生、发展与多种因素相关，如氧化应激、肥胖、糖尿病、脂质代谢异常、胰岛素抵抗以及低度炎性反应等[7]。肝脏是对氧化应激和脂质过氧化损伤非常敏感的器官，氧化应激是NAFLD中肝纤维化的关键因素[8]。氧化应激产生的活性氧簇(ROS)不但可损伤肝细胞，还可通过激活氧化应激与脂质过氧化通路进一步加重肝细胞损伤,从而引发肝脏炎性反应甚至肝硬化、肝细胞癌[9]。

人体存在很多抗氧化系统，如GSH、SOD、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等[10-13]。研究发现，在NAFLD大鼠模型中，抗氧化物SOD、CATSP 均显著下降，表现为氧化应激状态，并可通过抑制NOX4蛋白的表达进行调控，抑制肝纤维化的发生、发展[14]。研究发现，NOX4的表达受到lncRNA H19的抑制，过表达的lncRNA H19通过对NOX4的抑制而延缓了肝纤维化的发生、发展[15]。本实验建立了NAFLD大鼠模型，从各组大鼠的体质量、肝脏湿重、肝脏指数、病理以及血清ALT、AST、TC、TG可见，与对照组相比，模型组、空载体组、过表达H19组均有不同程度的肝脏病变。而与模型组、空载体组相比，过表达H19组的上述指标均有不同程度的预后改善，提示过表达lncRNA H19可能对高脂饮食所致的NAFLD大鼠的肝损伤有一定的保护作用。本实验还检测了各组大鼠肝组织中氧化应激相关指标SOD、GSH、MDA水平以及NOX4 mRNA、TGF-β1 mRNA、CTGF mRNA的表达水平，结果显示与对照组相比，模型组、空载体组、过表达H19组的上述指标均有不同程度的改变，而与模型组、空载体组相比，过表达H19组的上述氧化应激指标则有明显改善。本研究进一步验证了NOX4蛋白的表达情况，也得到了同样的结果。这些结果提示，NAFLD大鼠的肝损伤伴随着氧化应激的改变，并且氧化应激可能对NAFLD大鼠的肝损伤有至关重要的促进作用；过表达lncRNA H19可能抑制了NOX4的表达，进而抑制了NOX4对氧化应激的激活作用，从而起到对高脂饮食诱导的NAFLD大鼠肝损伤的保护作用。今后将进一步验证过表达lncRNA H19对其他参与NAFLD发生、发展的信号通路的作用，以弥补本研究的局限。

综上所述，过表达lncRNA H19可通过抑制NOX4的表达抵抗氧化应激的激活，进而对高脂饮食诱导的NAFLD大鼠的肝损伤起保护作用。lncRNA H19可能是NAFLD的新靶点，今后有待对其机制进行深入探讨。