拉曼光谱联合ICP-AES 法鉴定鹿茸真伪

冯 源高丽君韩 笑苑广信孙晶波∗

（1.北华大学药学院，吉林 吉林 132013；2.北华大学医学技术学院，吉林 吉林 132013）

鹿茸是指梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化而带茸毛的幼角，是名贵的药材［1］。《本草纲目》 记载鹿茸、鹿角、鹿角胶、鹿角霜、鹿鞭、鹿血、鹿脑、鹿尾、鹿肾、鹿筋、鹿脂、鹿肉、鹿头肉、鹿骨、鹿齿、鹿髓等都可入药，有极高的药用价值和保健功能，能够预防和治疗多种疾病。而鹿的初生幼角—鹿茸更是被视作“宝中之宝”［2］。鹿茸中的性激素对女性的更年期综合征有预防和治疗作用，其中的生物碱基，包括尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷等具有抑制单胺氧化酶的抗衰老作用，尤其有研究表明其中含有的胰岛素样生长因子（IGF-1），对糖尿病及其并发症有特殊的疗效［3］。鹿茸中也含有丰富的微量元素，如Ca、Co、Mg、P、Mn、Cu 等微量元素，这些微量元素不仅参与骨骼和软组织的构成，也是细胞中许多维持生命的化合物的重要成分，并能够促进人体对鹿茸中有效成份的吸收［4］。然而市场上常有采用茸角无药效动物，如水鹿、白臀鹿、白唇皮等茸角伪充鹿茸销售［5］。为更好地鉴别鹿茸样品的真伪，一种快速有效的鉴别方法尤为重要。

拉曼光谱（SERS），是一种散射光谱。无论样品是固体、液体、胶体、粉末、还是软膏都可以快速表征其化学成分和结构［6］。相比于其他常规分析方法，具有样品制备简单，操作方便，不受水份干扰，样品可回收，绿色环保等优点［7］。近年来SERS 也多被用于食品、药品、生物制品的鉴定中。其具有检测限低、吸附选择性良好，可以增强振动信号的优点，因此在中药鉴定中具有重要意义［4］。

电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP-AES），利用样品受到激发后发射出光谱的波长及强度，对样品进行定性及定量分析。目前多用ICP 作为激发光源，ICP-AES 方法具有检出限低、精确度高、选择性好、线性范围宽、分析速度快、测定范围广等特点，能够同时测定多种元素，从而被广泛应用于中药分析［8］。

鹿茸中有效成分复杂，依靠单一组分无法进行真伪鉴别［2］。SERS 法可以直接测得鹿茸样品，全面表征其中多种成分的共同特征［9］；而ICP-AES 可同时检测样品中多种微量元素，借以对不同样品进行分析、鉴别［7］。鉴于上述分析，课题组采用上述2 种方法相结合对鹿茸进行定性鉴定，以期建立快速、稳定、有效的真伪鉴别方法［10］。

1 方法

1.1 材料 Renishaw inVia 显微拉曼光谱仪（英国雷尼绍公司）；VISTA-MPX 电感耦合等离子体原子发射光谱仪（美国瓦瑞安公司）；MAS 微波消解仪（上海新仪微波化学科技有限公司）。硝酸、浓盐酸均为优级纯、溴化钾、硝酸银、柠檬酸三钠，均购自吉林市欣利化学试剂有限公司。标准离子贮备液：国家标准溶液（1 000 μg/mL），购自国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院。

实验所用20 例正品鹿茸样品为梅花鹿茸和马鹿茸样品（北京同仁堂新城药店、吉林省长春市双阳区鹿乡、吉林省吉林市汇丰参茸行、吉林省吉林市龙潭区鹿厂）；35 例伪品鹿茸（国药控股国大药店、安国万达、史有开中医诊所、恒瑞白云店、吉林省长春市双阳区鹿乡、珠海生来堂药店、吉林省吉林市汇丰参茸行）。所有样品均经吉林市食品药品检定所金英兰主任药师进行真伪鉴定。

1.2 测试条件

1.2.1 SERS 条件 光谱测量范围0～3 200 cm-1；采用波长为633 nm 激光作为光源；总功率20 mA；物镜50 倍；激发光源的强度均为10%；扫描时间约1 min；平均扫描3次［11］。最佳检测波长见表1。

1.2.2 ICP-AES 条件功率 1 000 W；等离子 气15 mL/min；辅助气体积流量200 kPa；雾化气、自动积分及接口吹扫均开启；采用多色器高吹。

表1 各元素最佳检测波长

1.3 处理方法

1.3.1 样品处理 鹿茸粉末，取鹿茸切片，冷冻干燥48 h，取出，研磨，过100 目筛，分别放入1.5 mL EP 管中，编号，于4 ℃条下保存备用。

1.3.2 银胶溶液配制 参考Lee 等［12］的方法，以柠檬酸三钠还原硝酸银制备银纳米粒子。取硝酸银溶液100 mL 放于磁力搅拌器上搅拌（1 000 r/min）加热至90 ℃，再将2.6 mL 柠檬酸三钠溶液（0.039 mol/L）逐滴加入，保持90 ℃恒 温1 h，直到溶 液呈黄绿色，避光保存（现配现用）。

1.3.3 SERS 法 取适量样品置于载玻片上，滴加“1.3.2”项下新制银胶溶液，待其成糊状后，用载玻片压平并进行拉曼扫描检测。

1.3.4 ICP-AES 方法 取样品0.2 g 于消化管中，依次加入浓硝酸6 mL、浓盐酸2 mL，浸泡24 h，将消化管放入微波消解仪器中，消解功率1 000 W，升温8 min 至110 ℃保持6 min，再升温至140 ℃维持6 min，升温至180 ℃维持30 min，消解完成后将消化管直接放入加热套中，150 ℃条件下赶酸，待酸剩余1 mL 左右取出，将剩余液体转入25 mL 量瓶中，用去离子水定容后直接进样、检测。

1.4 数据处理

1.4.1 SERS 数据预处理 为排除其他因素对SERS 的影响，应用Origin8.0 软件对SERS 进行平滑处理以消除噪声，得到SERS 信号，进而在0～3 500 cm-1范围内对每条谱线进行归一化处理，便于比较不同光谱的形状及光谱强度之间的差异，最后得出真、伪鹿茸样品的平均表面增强拉曼光谱。

1.4.2 统计学方法 采用SPSS 16.0 对两独立样本的强度均值进行独立样本t检验分析；建立Fisher 识别函数。

1.4.3 ICP-AES 选取鹿茸中所含的5 种人体必需的常量元素，Ca、K、Mg、P、Na；人体必需的微量元素，Fe、Zn、Mn、Sr、Cr；一般无机元素，Ba 为代表，进行ICPAES 检测［13］。运用Graphpad prism 软件对数据进行处理，建立元素含有量折线图，以便于对鹿茸样品中元素含有量进行快速分析。

2 结果与讨论

2.1 拉曼光谱及分析

2.1.1 条件及方法选择 鹿茸样品的常规拉曼光谱以及表面增强拉曼光谱，见图1，鹿茸粉末直接测试拉曼光谱（1A）没有明显的特征吸收峰，只有一个荧光包，这应该是由于中药材中成分含有量复杂、自身荧光较强导致的。然而经过测试，滴加了新制银胶溶液的鹿茸样品，则出现了多个吸收峰，选取多个样品点，验证得出了SERS 图，该图非常稳定，特征拉曼吸收峰的位置固定，因此可用来鉴别鹿茸的真伪。

图1 鹿茸粉末样品SERS 图

2.1.2 结果 扫描后运用Origin8.0 软件得正品和伪品鹿茸2 组样品面积归一化后的SERS 光谱，见图2，选取0～3 500 cm-1的区间范围作为研究对象，鹿茸的生物分子归属见表2［14-21］。真、伪鹿茸的平均SERS 光谱的形态和谱峰大体相 似。主要的 谱峰位 于155、227、723、954、999、1 094、1 322、1 460、1 587、2 918 cm-1位移处，但谱峰强度存在差异（P＜0.05），进一步采用独立样本t检验进行组间两两比较，结果 显示在155、227、723、954、999、1 094、1 322、1 460、1 587 cm-1位移处正品鹿茸的SERS强度强于伪品鹿茸（P＜0.05），差异有统计学意义；在2 918 cm-1位移处伪品鹿茸的 SERS 强度强于正品（P＜0.05），差异有统计学意义。真伪2 组鹿茸样品的SERS 光谱强度比较，见表3。

表2 鹿茸SERS 谱峰归属

2.1.3 Fisher 识别函数建立 分别选取5 个经上述拉曼检测已知真伪的鹿茸正品及伪品样品归一化的SERS 吸收峰强度值，运用SPSS 16.0 建立判别鹿茸样品真伪的Fisher识别函数，通过计算得出正品及伪品的判别函数如下，（F1 代表正品鹿茸样品组，F2 代表伪品鹿茸样品组，X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7分别为鹿茸155、227、723、959、999、1 094、1 322 cm-1位移所对应的拉曼强度）。

图2 正品与伪品鹿茸归一化后平均SERS 光谱

表3 真伪2 组鹿茸样品的SERS 光谱强度比较

若F2＞F1，鹿茸为伪品；F2＜F1，鹿茸为正品。

2.1.4Fisher识别函数验证 表4 表明，55 个鹿茸样品中，20 个鹿茸样品有19 个准确识别，准确率为95%；35个伪劣鹿茸中有34 个准确识别，准确率为97%。由此可见Fisher 函数对已知真伪的鹿茸具有很好的识别效果，这一方法可用于未知鹿茸样品鉴别。

表4 识别函数对已知样本的识别效果

2.2 微量元素含有量 将上述53 种来源不同的真、伪鹿茸片进行ICP-AES 检测，检测结果见表5～6。

表5 不同来源正品鹿茸片中11 种微量元素含有量平均值（n＝5，mg/kg）

本研究检测了鹿茸样品中Ba、Ca、Cr、Fe、K、Mg、Mn、Na、P、Sr、Zn 等11 种元素的含有量，见图3～4，其中Na 元素的含有量在20 例正品鹿茸中的平均含有量1 000≤Na ≤1 500 mg/kg，而伪品鹿茸中含有量为Na ＜1 000 mg/kg；正品鹿茸中K 元素含有量均大于等于500 mg/kg，伪品鹿茸K＜500 mg/kg。通过计算元素含有量的平均值，见表5～6，发现正品鹿茸中Ca、Mg、Na、P、Zn 的含有量平均高于伪品鹿茸，而Fe、Sr 的平均含有量伪品鹿茸高于正品鹿茸，但差距不是很大。

图3 真伪鹿茸样品中Na 元素平均含有量走势图

表6 不同来源伪品鹿茸片中11 种微量元素含有量平均值（mg/kg）

图4 真伪鹿茸样品中K 元素平均含有量走势图

3 结论

中药成分含有量复杂，各成分含有量比例也不同，因此其光谱也具有差异［22］，本研究利用表面增强SERS 法、微量元素检测法对55 种鹿茸样品进行分析。运用SERS 法可以通过155、227、723、954、999、1 094、1 322、1 460、1 587 cm-1位移处正品鹿茸的SERS 强度强于伪品鹿茸（P＜0.05），差异有统计学意义；在2 918 cm-1位移处伪品鹿茸的SERS 强度强于正品（P＜0.05），差异有统计学意义，进行鹿茸的真伪鉴别且通过SERS 检测所得拉曼强度建立的Fisher 识别函数，对已知鹿茸的鉴别正确率达96%，因此可以通过Fisher 识别函数结合拉曼光谱法实现对鹿茸的准确识别。

微量元素检测法可以通过分析人体必需常量元素Na、K 元素在鹿茸中的含有量对真伪鹿茸进行鉴别，正品鹿茸中Na 元素含有量应1 000 ≤Na ≤1 500 mg/kg、K 元素含有量也应大于等于500 mg/kg［23］。

因此，表面增强拉曼光谱法联合应用Fisher 识别函数以及微量元素检测法更适用于对鹿茸样品的鉴别，该方法准确、有效。根据研究结果建立鹿茸真伪的鉴别方法，利用鹿茸对照品建立其表面增强拉曼光谱库，以期为鹿茸的研究提供依据。