穿心莲内酯对宫颈癌U14 荷瘤小鼠抗肿瘤作用的影响

魏东艳，魏冬梅，滕 利∗

（1.吉林省妇幼保健院，吉林 长春 130000；2.松原市中西结合医院，吉林 松原 138000）

宫颈癌是发病率仅次于乳腺癌的女性恶性肿瘤，严重威胁女性健康，是导致女性死亡的主要病因之一［1］。手术治疗是宫颈癌早期患者的主要治疗手段，但很多患者在就诊时已是晚期，失去了手术机会；放疗也可以用于宫颈癌的治疗，但其对阴道和卵巢造成不可逆的损害；而传统的化疗药物有耐药性、不良反应等缺点，其应用也存在较大的局限性［2］。随着祖国医学的发展，从传统中医药中分离具有抗肿瘤活性的天然化学成分，并在其基础上进行结构修饰、改造，进而发现低毒、高效的抗肿瘤活性物质，已成为抗肿瘤药物研发的热点领域［3］。

穿心莲内酯为二萜内酯类化合物，具有抗肿瘤、免疫调节、抗病毒感染、抗炎、抗菌及保肝利胆等多种活性。研究表明，穿心莲内酯具有抗黑色素瘤、肾癌、肝癌、乳腺癌及结肠癌等作用［4-5］。体外实验表明，穿心莲内酯可以抑制宫颈癌Hela 细胞的增殖及促进凋亡，此外，顺铂与穿心莲内酯联合使用，具有协同抑制宫颈癌Hela 细胞增殖作用［6-7］。但是穿心莲内酯对宫颈癌的体内研究作用，报道较少。因此。通过建立宫颈癌U14 荷瘤小鼠模型，在明确穿心莲内酯具有体内抗宫颈癌的基础上，进一步探讨其对免疫功能及诱导凋亡作用的影响，初步阐明抗宫颈癌机制。

1 材料

1.1 细胞株及实验动物 小鼠宫颈癌U14 细胞购于美国ATCC 细胞库；雄性昆明小鼠，体质量18～22 g，SPF 级，由吉林大学实验动物中心提供，生产许可证号SCXK（吉）2015-0006。

1.2 试剂与药物 穿心莲内酯（上海源叶生物科技有限公司，批号170511）；艾迪注射液（贵州益佰制药股份有限公司，批号20170403）；抗小鼠CD4（批号sc-32811）、CD8（批号sc-32812）、Fas（批号sc-4856）、Fas L（批号sc-4855）及Bax（批号sc-7480）单克隆抗体均购自美国Santa Cruz 公司；内参蛋白抗小鼠GAPDH（批号b8-0459R）多克隆抗体购于北京博奥森生物技术公司。

1.3 仪器 SW-CJ-1FD 超净工作台（上海力辰仪器科技有限公司）；BPN-240CRH CO2培养箱（上海一恒科学仪器公司）；5810R 低温高速离心机（德国Eppendorf 公司）；Bio-Rad蛋白电泳仪及转印仪（美国Bio-Rad 公司）；FACSCalibur 流式细胞仪（美国BD 公司）。

2 方法

2.1 造模 常规条件复苏、培养保存于液氮中的U14 细胞，细胞生长至对数生长期时，调整细胞浓度为1×107/mL，每只小鼠腹腔注射0.1 mL 细胞悬液至体内进行扩增。10 d 后，无菌条件下进行局部腹腔穿刺，抽取腹水，留存乳白色浓稠状腹水；离心，经Hanks 液洗涤2 次，调整细胞浓度为1×107/mL。取0.1 mL 细胞悬液，在小鼠右前肢腋窝部位接种，10 d 后注射部位可见米粒大小瘤块，视为建模成功。

2.2 分组、给药 选取造模成功的40 只荷瘤小鼠随机分为正常对照组、模型组、艾迪注射液组（20 mg/kg）、穿心莲内酯高、低剂量组（40、20 mg/kg），每组10 只。正常对照组小鼠右前肢腋窝部位注射0.1 mL 生理盐水；实验期间正常对照组和模型组小鼠腹腔注射生理盐水，艾迪注射液组及穿心莲内酯高、低剂量组小鼠分别腹腔注射相应剂量的药物，1 次/d，给药周期14 d，期间密切观察小鼠一般状态。

2.3 检测体质量、瘤重、抑瘤率、胸腺指数和脾脏指数 各组小鼠于第14 天称定质量后，摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠。剥离瘤体、胸腺及脾脏，精确称定质量。计算抑瘤率、胸腺指数和脾脏指数。抑瘤率=［（模型组肿瘤重-实验组肿瘤重）/模型组肿瘤重］×100%，胸腺指数=胸腺质量/体质量，脾脏指数=脾脏质量/体质量。

2.4 检测外周血T 淋巴细胞亚群 摘眼球取血后，肝素钠抗凝，按淋巴细胞分离液说明书分离淋巴细胞，制备细胞涂片。按照正碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶免疫复合物法（alkaline phosphotase anti-alkaline phosphotase，APAAP）检测试剂盒中的操作说明，依次加入CD4+和CD8+单抗、对应二抗、APAAP 复合物及底物，显色后检测穿心莲内酯对U14 荷瘤小鼠外周血T 淋巴细胞亚群的影响。

2.5 检测瘤组织Fas、Fas L 及Bax 蛋白表达 称取100 mg瘤组织，制备10% 组织匀浆液，BCA 法检测总蛋白。取10 μg 总蛋白，行12% SDS-PAGE 电泳后，转移至醋酸纤维素膜上。经脱脂奶粉封闭2 h 后，分别加入抗小鼠Fas、Fas L 及Bax 单克隆抗体及内参蛋白GAPDH 抗体，除GAPDH 抗体1∶1 000 倍稀释外，其余抗体均1∶500 稀释。4 ℃条件下放置过夜，TBST 漂洗后，加入相应的二抗，常温放置2 h。经洗膜、显色等步骤后，分析各条带灰度值，以目的蛋白条带与内参GAPDH 蛋白条带灰度值之比表示瘤组织Fas、Fas L 及Bax 蛋白的相对表达量。

2.6 统计学分析 采用SPSS 13.0 统计软件进行分析，数据以（）表示，多组间比较采用方差分析，组间比较采用2 个独立样本t检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 穿心莲内酯对U14 荷瘤小鼠一般状态及体质量的影响 正常对照组小鼠皮毛浓密光泽、反应灵活、动作敏捷、精神状态良好，模型组小鼠皮毛稀疏无光泽、反应迟钝、行动迟缓、精神状态较差，艾迪注射液组及穿心莲内酯高、低剂量组小鼠一般状态良好。给药前各组小鼠体质量差异无统计学意义（P＞0.05）。给药14 d 后，与正常对照组比较，模型组小鼠体质量降低（P＜0.05）；与模型组比较，艾迪注射液组及穿心莲内酯高、低剂量组小鼠体质量增加（P＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠体质量比较（，n＝10）

表1 各组小鼠体质量比较（，n＝10）

注：与正常对照组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

3.2 穿心莲内酯对U14 荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率的影响 给药14 d 后，与模型组比较，艾迪注射液组及穿心莲内酯高、低剂量组小鼠瘤重降低（P＜0.05）；艾迪注射液组、穿心莲内酯高、低剂量组的抑瘤率分别为29.88%、21.34%、16.46%。见表2。

表2 各组小鼠瘤重及抑瘤率比较（，n＝10）

表2 各组小鼠瘤重及抑瘤率比较（，n＝10）

注：与模型组比较，∗P＜0.05。

3.3 穿心莲内酯对U14 荷瘤小鼠胸腺、脾脏指数的影响给药14 d 后，与正常对照组比较，模型组小鼠胸腺指数和脾脏指数降低（P＜0.05）；与模型组比较，艾迪注射液组及穿心莲内酯高剂量组小鼠胸腺指数和脾脏指数增加（P＜0.05）。见表3。

表3 各组小鼠胸腺指数和脾脏指数比较（，n＝10）

表3 各组小鼠胸腺指数和脾脏指数比较（，n＝10）

注：与正常对照组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

3.4 穿心莲内酯对U14 荷瘤小鼠外周血T 淋巴细胞亚群的影响 给药14 d 后，与正常对照组比较，模型组小鼠外周血CD4+T 淋巴细胞水平及CD4+/CD8+比值降低，而CD8+T淋巴细胞水平增加（P＜0.05）；与模型组比较，艾迪注射液组及穿心莲内酯高、低剂量组小鼠外周血CD4+T 淋巴细胞水平及CD4+/CD8+比值增加，而CD8+T 淋巴细胞水平降低（P＜0.05）。见表4。

表4 各组小鼠外周血T 淋巴细胞亚群比较（，n＝10）

注：与正常对照比较，∗P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

3.5 穿心莲内酯对U14 荷瘤小鼠瘤组织Fas、Fas L 及Bax蛋白表达的影响 给药14 d 后，与模型组比较，艾迪注射液组及穿心莲内酯高、低剂量组小鼠瘤组织Fas、Bax 蛋白表达增加，而Fas L 蛋白表达降低（P＜0.05）。见表5、图1。

表5 各组小鼠瘤组织Fas、Fas L 及Bax 蛋白表达比较（，n＝10）

表5 各组小鼠瘤组织Fas、Fas L 及Bax 蛋白表达比较（，n＝10）

注：与模型组比较，∗P＜0.05。

图1 Western blot 法检测各组小鼠瘤组织Fas、Fas L 及Bax 蛋白表达

4 讨论

我国药用植物资源极为丰富，从中筛选具有抗肿瘤作用的有效成分，并明确其作用机理，对于抗肿瘤药物的研发将具有重要意义［8］。目前，来源于植物药的抗肿瘤制剂（如长春新碱、喜树碱及紫杉醇等）已成为许多肿瘤化疗的首选药物［9］。本研究以宫颈癌U14 荷瘤小鼠模型为对象，通过给予穿心莲内酯治疗后，发现穿心莲内酯可以改善U14 荷瘤小鼠一般状态，与模型组比较，穿心莲内酯组小鼠体质量明显增加，而瘤重明显降低；以上结果提示穿心莲内酯对U14 荷瘤小鼠的肿瘤生长具有抑制作用。

机体的免疫功能状态与恶性肿瘤的发生、进展、转移及复发密不可分，机体不同程度的免疫功能失衡是导致肿瘤细胞逃避机体免疫监视，得以无限增殖的一个重要原因［10］。本研究发现，穿心莲内酯高、低剂量组小鼠胸腺指数和脾脏指数均有不同程度的增加，提示穿心莲内酯对U14 荷瘤小鼠的免疫器官具有一定的保护作用。细胞免疫是抗肿瘤免疫的主要方式之一，当T 淋巴细胞亚群出现异常时，细胞免疫功能调节失常，包括肿瘤在内的免疫系统疾病的发生率会大大增加［11］。按照表面标志物的不同，T淋巴细胞亚群可分为CD4+亚群和CD8+亚群，CD4+T 淋巴细胞减少会导致肿瘤细胞逃避机体的免疫监视，引发肿瘤细胞异常增殖；CD8+T 淋巴细胞在免疫反应中起负向调节作用，当CD8+T 淋巴细胞细胞增多时，有利于肿瘤生长［12］。本研究发现，给予U14 荷瘤小鼠穿心莲内酯14 d后，与模型组比较，穿心莲内酯高、低剂量组小鼠外周血CD4+T 淋巴细胞水平及CD4+/CD8+比值明显增加，而CD8+T 淋巴细胞水平明显降低，此结果进一步表明，穿心莲内酯抑制U14 荷瘤小鼠肿瘤生长的作用可能与免疫调节作用有关。

细胞凋亡过程受阻是肿瘤发生、发展的另一重要原因。Fas 为跨膜糖蛋白，分布于多种细胞表面，是细胞凋亡的信号分子；Fas L 是Fas 在体内的天然配体，二者结合后，活化并传导凋亡信号，从而诱导肿瘤细胞发生凋亡［13］。研究表明，Fas 蛋白的表达与肿瘤细胞的凋亡水平呈正相关，而Fas L 蛋白表达与肿瘤细胞凋亡呈负［14］。Bax 是Bcl-2 家族蛋白中的重要促凋亡蛋白，其可以通过调控细胞凋亡来发挥调节肿瘤细胞生长状态的作用［15］。本研究采用Western blot 法检测了穿心莲内酯对各组小鼠瘤组织Fas、Fas L 及Bax 蛋白表达的影响，发现穿心莲内酯高、低剂量组小鼠瘤组织Fas 及Bax 蛋白表达明显增加，而Fas L 蛋白表达明显降低，以上结果表明，穿心莲内酯可以诱导U14荷瘤小鼠肿瘤细胞发生凋亡。

综上所述，穿心莲内酯对U14 荷瘤小鼠的肿瘤生长具有抑制作用，其机制与提高免疫力及诱导凋亡作用有关。