芩麻颗粒前处理工艺的优化

张 依李 婷丁 越邹纯朴田娟娟张 彤∗

（1.上海中医药大学中药学院，上海 201203；2.上海中医药大学教学实验中心，上海 201203；3.上海中医药大学基础医学院，上海 201203）

芩麻方是国医大师裘沛然教授的临床经验方，经小青龙汤演变而来，主要由麻黄、黄芩、甘草等7 味中药组成，具有寒热并用、敛散相伍的配伍特征，主治寒邪痰热内蕴之哮喘、咳嗽，临床上主要用于支气管哮喘、慢性支气管炎等病症［1］，该方临床使用已有四十多年，具有较好的疗效和安全性。支气管哮喘作为一种最常见的慢性呼吸道疾病［2-3］，其治疗不仅消耗了大量卫生资源，而且因劳动力丧失导致严重的社会经济负担，目前全球约有3 亿患者，所造成的疾病负担占全球所有疾病伤残调整生命年的1%，与糖尿病相当［4］，其特征是反复发作的呼吸困难和喘息，严重程度和发生频率因人而异［5-6］。目前，临床治疗支气管哮喘以激素药物治疗为主，如糖皮质激素、β2-受体激动剂、白三烯受体拮抗剂、茶碱类药物等［7-8］，这些药物虽然起效快，但存在许多副作用及不良反应，不适合长期服用；芩麻方临床上表现出长效、低毒、副作用少等优势［9］，故按照中药现代化的要求将芩麻方其成携带、服用方便的颗粒剂，将有利于该类疾病的治疗。

芩麻方中主要成分为盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、没食子酸、黄芩苷、龙胆苦苷等［10-13］，其中黄芩苷具有治疗支气管哮喘、抑菌、利尿、抗炎、抗变态作用［14-15］。因此，故本实验采用HPLC 法测定芩麻颗粒中黄芩苷含有量，不仅考察了该成分提取方法，并比较了不同品牌、材质微孔滤膜对黄芩苷的吸附作用，以及高速离心、微孔滤膜滤过法对黄芩苷的前处理效果，为该制剂后续研究提供实验依据。

1 材料

1.1 药材 黄芩（产地山西，批号161122）、麻黄（产地内蒙，批号 160812）、甘草（产地甘肃，批号161215）、干姜（产地山东，批号161117）、龙胆（产地云南，批号160906）、细辛（产地辽宁，批号161216）、诃子（产地广西，批号161220）均购于上海虹桥中药饮片有限公司，经上海中医药大学教学实验中心宋龙博士鉴定为正品。

1.2 试剂与药物 芩麻颗粒（批号171203）由中药现代化生产中试（孵化）基地生产。黄芩苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号110715-200815，质量分数93.5%）。0.45 μm 尼龙微孔滤膜和0.45 μm 聚四氟乙烯微孔滤膜购于上海安谱实验科技股份有限公司、迪马科技有限公司、美国安捷伦科技公司、天津市领航实验设备有限公司、天津莱博飞特生物科技有限公司、上海泰坦科技股份有限公司。甲醇为色谱纯（美国Sigma-Aldrich 公司）；95%乙醇、无水乙醇、甲醇、磷酸均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；水为双蒸馏水。

1.3 仪器 BS124S 电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；XS105DU 电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；JA5002 电子天平（上海精天电子仪器有限公司）；Agilent Technologies 1200 Series 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；TGL-16B 低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；DZF-6050 真空干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；SB-5200D 超声波清洗机（宁波新艺生物科技股份有限公司）；HHS 电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。

2 方法与结果

2.1 黄芩苷含有量测定

2.1.1 对照品溶液制备 取黄芩苷对照品适量，75%甲醇制成高（339.6 μg/mL）、中（33.96 μg/mL）、低（3.396 μg/mL）质量浓度的溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液制备 取颗粒约0.2 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入25 mL 75%甲醇，称定质量，超声提取20 min，冷却至室温后75%甲醇补足减失的质量，15 000 r/min 离心10 min，取上清液，即得。

2.1.3 色谱条件 迪马-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇（A）-0.3% 磷酸（B），等度洗脱（50∶50）25 min；检测波长280 nm；柱温30 ℃；体积流量1.0 mL/min；进样量10 μL，色谱图见图1。由此可知，黄芩苷能与其他组分完全分离（R≥1.5），理论塔板数按该成分色谱峰计不低于2 500。

2.1.4 线性关系考察 取黄芩苷对照品溶液适量，75%甲醇稀释成325.4、260.3、195.2、130.2、65.08、32.54、13.02、6.508、3.254 μg/mL，各精密吸取10 μL，在“2.1.3”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得方程为Y=36.871X-60.518（r=0.999 7），在3.254～325.4 μg/mL 范围内线性关系良好。

图1 黄芩苷HPLC 色谱图

2.1.5 精密度试验 精密吸取高、中、低质量浓度的黄芩苷对照品溶液各10 μL，同一天内在“2.1.3”项色谱条件下进样测定6 次，计算日内精密度；连续3 d，计算日间精密度。结果，日内、日间精密度RSD 分别小于1.0%、0.9%，表明该方法精密度良好。

2.1.6 重复性试验 取颗粒适量，按“2.1.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1.3”项色谱条件下进样测定，测得黄芩苷含有量RSD 为0.5%，表明该方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，室温下于0、2、4、6、8、10、12、24 h 在“2.1.3”项色谱条件下进样测定，测得黄芩苷峰面积RSD 为1.3%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.8 加样回收率试验 取黄芩苷含有量已知的颗粒，分别加入相当于该成分含有量80%、100%、120% 的对照品溶液，按“2.1.2”项下方法平行制备3 份供试品溶液，在“2.1.3”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表1。

2.2 前处理工艺优化

2.2.1 颗粒研磨 颗粒研磨成细粉（过80 目筛），取约0.2 g，精密称定，置于250 mL 具塞锥形瓶中，精密加入100 mL 50%甲醇，称定质量，超声（300 W、25 kHz）提取30 min，平行3 份，冷却至室温后50%甲醇补足减失的质量，收集提取液；另取颗粒，不研细，取约0.2 g，精密称定，同法处理，15 000 r/min 离心10 min，测定黄芩苷含有量，结果见表2。由此可知，颗粒研磨前后黄芩苷含有量无明显变化，可能是该成分在50% 甲醇中溶解性较好，但考虑到颗粒研磨过程中容易吸潮，称量操作不便，故选择不研磨而直接提取。

表1 黄芩苷加样回收率试验结果（n＝3）

表2 颗粒研磨对黄芩苷含有量的影响（n＝3）

2.2.2 提取方法 取颗粒约0.2 g，精密称定，置于250 mL 具塞锥形瓶中，精密加入100 mL 50%甲醇，称定质量，分别超声、回流、60 ℃水浴热浸提取30 min，平行3 份，冷却至室温后50% 甲醇补足减失的质量，收集提取液，15 000 r/min离心10 min，测定黄芩苷含有量，结果见表3。由此可知，超声、回流提取下黄芩苷含有量高于热浸法，但两者无明显差异，故选择操作更简便的超声提取。

表3 提取方法对黄芩苷含有量的影响（n＝3）

2.2.3 提取溶剂种类 取颗粒约0.2 g，精密称定，置于250 mL具塞锥形瓶中，精密加入水、乙醇、甲醇、25% 甲醇、50%甲醇、75%甲醇各100 mL，称定质量，超声提取30 min，平行3 份，冷却至室温后50%甲醇补足减失的质量，收集提取液，15 000 r/min 离心10 min，测定黄芩苷含有量，结果见表4。由此可知，75%甲醇提取时黄芩苷含有量最高，故选择该溶剂。

2.2.4 提取溶剂体积 取颗粒约0.2 g，精密称定，置于50、100、250 mL 具塞锥形瓶中，精密加入10、25、50、100 mL 75%甲醇，称定质量，超声提取30 min，平行3 份，冷却至室温后50% 甲醇补足减失的质量，收集提取液，15 000 r/min 离心10 min，测定黄芩苷含有量，结果见表5。由此可知，25 mL 提取时黄芩苷含有量最高，故选择该体积。

表4 提取溶剂种类对黄芩苷含有量的影响（n＝3）

表5 提取溶剂体积对黄芩苷含有量的影响（n＝3）

2.2.5 提取时间 取颗粒约0.2 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入25 mL 75%甲醇，称定质量，超声提取5、10、20、30、60 min，平行3 份，冷却至室温后50%甲醇补足减失的质量，收集提取液，15 000 r/min 离心10 min，测定黄芩苷含有量，结果见表6。由此可知，提取20 min 后黄芩苷含有量无明显变化，考虑到效率因素，故选择提取时间20 min。

表6 提取时间对黄芩苷含有量的影响（n＝3）

2.3 提取液除杂 采用HPLC 法测定提取液中成分含有量时，一般需采用微孔滤膜或超速离心去除悬浮粒子，以免堵塞色谱柱。通过预实验发现，微孔滤膜处理颗粒提取液时对黄芩苷具有一定吸附性，而且不同材质的吸附性有所差异，故有必要比较微孔滤膜、超速离心的处理效果，以及两者对黄芩苷吸附性的影响。

取“2.1.1”项下对照品溶液、“2.1.2”项下供试品溶液适量，15 000 r/min 离心10 min；另取2 种溶液适量，经不同品牌、材料0.45 μm 微孔滤膜过滤，测定黄芩苷含有量，计算其转移率，结果见图2，可知迪马科技有限公司所生产的0.45 μm 尼龙微孔滤膜，以及上海安谱实验科技股份有限公司、安捷伦科技有限公司所生产的0.45 μm聚四氟乙烯微孔滤膜对黄芩苷的吸附最少；同一品牌中，聚四氟乙烯滤膜对该成分的吸附明显少于尼龙滤膜。另外，与微孔滤膜法相比，高速离心法所得黄芩苷的转移率较高，故提取液前处理方法可采用该方法；如果采用微孔滤膜法，则可选择上海安谱实验科技股份有限公司、安捷伦科技有限公司所生产的0.45 μm 聚四氟乙烯微孔滤膜进行过滤。

图2 不同品牌、材料0.45 μm 微孔滤膜对黄芩苷转移率的影响

3 讨论与结论

本实验在处理芩麻颗粒提取液时发现，不同厂家、材料的0.45 μm 微孔滤膜对黄芩苷均有一定吸附性，故考察了不同品牌尼龙滤膜，以及同一品牌尼龙、聚四氟乙烯滤膜对该成分的吸附效果，发现由迪马科技有限公司生产的尼龙滤膜吸附量较小，成分转移率为81.76%～96.57%；聚四氟乙烯滤膜的吸附率相对较低，以安捷伦科技有限公司、上海安谱实验科技股份有限公司生产的最明显，成分转移率均高于95%。然后，将33.96 μg/mL 黄芩苷对照品溶液经天津市领航实验设备有限公司、天津莱博飞特生物科技有限公司生产的0.45 μm 尼龙微孔滤膜过滤，发现吸附率分别为37.60%、48.44%，2 倍体积甲醇洗脱后其回收率分别为93.05%、90.44%，进一步证明了以上2 个品牌较强的吸附性。目前，市场上有机相微孔滤膜的材料大多以尼龙为主，提示研究人员在进行类似实验时需要关注微孔滤膜对目标成分的吸附作用，从而选择更合适的提取液除杂方法。

综上所述，本实验不仅优化了芩麻颗粒前处理工艺，并成功建立其主要成分黄芩苷含有量的测定方法。同时，还首次发现微孔滤膜对芩麻颗粒中黄芩苷的吸附作用，并对目前市面上常见的微孔滤膜进行评估，为相关研究提供了重要的实验依据。