水稻苗期耐低锌种质资源鉴定与筛选

王芳 杨婷 周乾顺 武美燕 田小海 张文英

摘要：【目的】筛选与水稻耐低锌能力相关的指标，鉴定耐低锌水稻品种，为耐低锌水稻品种的遗传改良及遗传机理研究提供参考。【方法】通过水培方法，在低锌条件下测定来自国际水稻研究所的144份水稻核心种质资源的形态、生理性状、种子糙米和精米锌含量，并采用相关分析、主成分分析、聚类分析和逐步回归分析进行水稻耐低锌能力评价。【结果】低锌条件下，水稻各性状平均值均有所下降，与足锌处理相比，各性状均值分别降低7.25%～60.45%，其中地上部鲜重、根系干重、地上部干重、根系鲜重、叶面积和根系体积下降比例均超过30.00%。主成分分析和逐步回归分析结果表明，株高、叶长、叶宽、SPAD值、根系鲜重、根系干重、根尖数、根系平均直径、鲜重根冠比和糙米锌含量对苗期水稻耐低锌能力有显著影响（P<0.05）。聚类分析结果表明，各水稻品系间耐低锌能力差异明显，共筛选出12份耐低锌材料。其中AUS稻中低锌耐受型品种有AUS 299：：IRGC 29087-1、N22、KOTODESHI：：IRGC 60982-1、AUS PADDY（RED）：：IRGC 44978-1和DV 86：：IRGC 8840-1，籼稻中低锌耐受型品种有DALSUNG 41、IRGA 659-1-2-2-2和UPR 191-66，粳稻中低锌耐受型品种有MEJANES 2和ALEXANDROS，其他品种中低锌耐受型品种有油占8号和CYPRESS：：G1-1。【结论】株高、叶长、叶宽、SPAD值、根系鲜重、根系干重、根尖数、根系平均直径、鲜重根冠比和糙米锌含量可作为水稻耐低锌能力的筛选指标。在土壤锌含量低的区域种植水稻时，可增加12份耐低锌材料的推广和利用。

关键词： 水稻;种质资源;低锌;种子;锌含量;表型性状

0 引言

【研究意义】水稻是最重要的粮食作物之一，我国水稻播种面积占全国粮食作物播种面积的四分之一（欧小雪等，2016），产量占一半以上。水稻属于低锌敏感作物，缺锌导致水稻植株矮小，节间缩短，分蘖变少，叶片脉间失绿白化，叶片叶绿素含量下降等症状。锌缺乏还会导致叶片对多余光照敏感性增强（Faran et al.，2019），使水稻更易受到强光、高温、低温及干旱的伤害，从而加深叶片的缺锌损害症状，进一步加剧产量损失。锌缺乏影响亚洲地区大概50%的水稻田，其中内陆碱性钠盐和滨海盐渍土产稻区所受影响尤为严重（Yang et al.，2019）。近年来的土壤微量元素调查结果显示，锌在世界范围内是最缺乏的一种微量元素，有49%的地区土壤存在不同程度的缺锌现象（樊明宪等，2016）。因此，鉴定和筛选在低锌條件下耐受性强的水稻品种，对解决水稻缺锌问题具有重要意义。【前人研究进展】目前，有关锌元素在水稻各器官转运及积累等方面的研究已趋于成熟，锌元素从营养组织到籽粒的运输机制及与锌运输有关的茎叶、籽粒中相关基因定位（Hussain et al.，2015;Gyawali et al.，2017），与水稻吸收转运富集锌铁元素有关的研究及基因定位（沈希宏等，2008;张现伟等，2009;梅忠等，2016;Lee et al.，2017）等均已有报道。在富锌水稻种质筛选中，吴敬德等（2006）从菲律宾国际水稻所种质资源中筛选出锌元素高达253.29和352.61 mg/kg的富锌水稻品种IR41994-50-2-1-3和IR68144-213-2-2-3。李婉等（2017）从黑龙江地区的137份粳稻种质资源中筛选出2份高锌粳稻种质L6和L170，其锌含量均略高于25.00 mg/kg。可见，粳稻种质中富锌品种与其他品系富锌种质相比，其锌含量处于较低水平。Ishikawa等（2017）发现一种对锌元素富集能力很强的野生品种，在9号染色体上精细定位出一个qGZn9高富集锌元素的基因，加速了富锌水稻的转基因育种。还有研究表明，水稻种子含有足够锌含量能显著提高种子发芽率、发芽指数和活力（王晓波和宋凤斌，2005）。这些研究成果为水稻富锌品种的选育提供了重要参考，但Kabir等（2014）认为，显著的遗传变异性是提高水稻锌含量的主要前提之一，耐低锌种质资源的筛选工作依旧是世界各国植物育种的一项重要任务。但由于土壤锌含量水平不一及复杂多变的外界因素影响，很多耐低锌水稻品种仍难以在一些地方正常生长和推广利用。因此，适应性更广泛、推广性更强的耐低锌水稻品种的选育需求仍十分紧迫。【本研究切入点】前人研究主要集中在锌缺乏条件下水稻各器官性状变化及下一代籽粒锌含量变化探讨，有关水稻种子中糙米及精米锌含量与其耐低锌能力相关性的研究鲜见报道;另一方面，有必要筛选出适应性更广泛且耐低锌能力强的水稻品种。【拟解决的关键问题】从3000份国际水稻所核心种重测序种质资源中随机选取144份发芽率及发芽势良好的品系（种），利用多元统计分析方法，筛选与水稻耐低锌能力相关的指标，鉴定耐低锌水稻品种，为耐低锌水稻品种的遗传改良及遗传机理研究提供参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试的144份水稻核心种质材料由国际水稻研究所（菲律宾）提供（表1），144份种质属3K种质资源的随机样本（Wang et al.，2018），遗传材料多样性丰富，参试品系（种）中以籼稻和AUS稻居多，分别为64份和20份，占比44.4%和13.9%;其次粳稻共18份，占比12.5%;其他品种共42份，占比29.2%。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 种子糙米和精米中锌含量测定 从供试的144份水稻材料2018年收获的种子中，各选取饱满的籽粒50 g，先用砻谷机（JDMZ 100）将水稻籽粒磨成谷壳和糙米，然后用不锈钢精米机（LTJM-2099）将糙米碾成精米，用ST-B100型玛瑙研磨仪将所有样品粉碎成粉末，收集于自封袋中。用干灰化法制备待测液，糙米和精米中锌含量采用原子吸收分光光度计（火焰法）测定（李文宗等，2018）。

1. 2. 2 水稻苗期水培试验 采用水培法，设低锌（-Zn，Zn2+ 2.0 μmol/L）和足锌（+Zn，Zn2+ 40.0 μmol/L）2个处理，在光照培养室（光照14 h/黑暗10 h，白天28 ℃/夜晚24 ℃，相对湿度75%，光照强度2000 lx）进行试验。育苗方式采用育秧盘育苗，种子经75%乙醇溶液消毒后，浸种2 d，37 ℃下催芽，挑选出芽好且一致的种子移栽在96孔板上，放入温室内（光照14 h/黑暗10 h，白天28 ℃/夜晚24 ℃，光照强度2000 lx），用蒸馏水培养，育苗生长至3叶，选长势一致的幼苗8株移栽至装有1/4完全营养液的盆钵（直径32.0 cm，高33.5 cm），缓苗后足锌组处理每盆加入足锌营养液4 L，低锌组处理每盆加入低锌营养液4 L，每品种3次重复。每2 d用蒸馏水及1.0 mol/L的NaOH将营养液pH调节至6.5±0.1，用自动通气装置通气，每5 d更换1次营养液。除锌浓度外其他元素浓度按国际水稻研究所推荐的水稻常规营养液配方（王人民等，2003b）进行。处理7 d后，开始测定株高、叶长、叶宽和出叶数目，用叶绿素仪（SPAD-502）测定倒二叶叶绿素含量（SPAD值），每周测定1次，待幼苗出现缺锌症状时，记录出现症状的时间。分别采集3个重复的植株，根系经 EDTA浸泡去除表面吸附的营养元素后，用双蒸水洗净擦干，分地上部和根系，测定鲜重，计算鲜重根冠比。根系用WinRhizo scanner（Regent，Canada）根系扫描仪分析总根长、根系表面积、根系体积和根尖数。地上部和根系鲜样于烘箱80 ℃杀青30 min，65 ℃烘干至恒重，测定干重，计算干重根冠比。

1. 3 数据处理

利用Excel 2010计算数据平均值，用R语言Z-score程序对数据进行Z标准化，用DPS 7.05进行主成分分析、聚类分析和逐步回归分析后进行水稻各品系间及品系内耐低锌能力评价。

1. 3. 1 低锌耐受相关指标 为缩减不同品系（种）间可能存在的差异，通过计算性状相对值来评价水稻的耐低锌能力（徐乐等，2018）。利用公式（1）计算耐低锌系数（α）：

α=[CK-TCK]  （1）

式中，CK为对照，T为低锌处理。若耐低锌系数出现负值，说明在低锌处理条件下，植物的生长状况优于对照组。

1. 3. 2 耐低锌能力综合评价 每一品种各综合指标的隶属函数值用公式（2）求得（周广生等，2003）：

u（Xj）=（Xj-Xmin）/（Xmax-Xmin）     j=1，2[…]n （2）

式中，Xj表示第j个综合指标的得分;Xmin表示第j个综合指标的最小值;Xmax表示第j个综合指标的最大值。

根据综合指标贡献率用公式（3）求得各综合指标的權重（周广生等，2003）：

Wj=Pj /[j=1nPj]    j=1，2[…]n                （3）

式中，Wj表示第j个综合指标在所有指标中的权重;Pj表示第j个综合指标的贡献率。

用公式（4）求出各材料的综合耐低锌能力系数（D）：

D=[j=1[u（xj）×Wj]]     j =1，2[…]n        （4）

式中，D表示各品系（种）耐低锌性的综合评价值。

2 结果与分析

2. 1 水稻耐低锌相关性状的表型及生理指标分析

2. 1. 1 低锌胁迫对主要农艺性状的影响 由表2可知，低锌条件下，水稻各性状平均值均有所下降，与足锌处理相比，各性状均值分别降低7.25%～60.45%，其中地上部鲜重、根系干重、地上部干重、根系鲜重、叶面积和根系体积下降比例均超过30.00%。此外，由低锌条件下主要农艺性状的极大值尤其是低锌下SPAD极大值的出现可知，144份材料中存在低锌胁迫下苗期可正常生长的耐低锌材料。

2. 1. 2 水稻耐低锌性状的相关性分析 经试验测定可知，参试水稻材料种子糙米的锌含量在10.76～74.32 mg/kg，精米锌含量在4.08～39.32 mg/kg。对低锌条件下检测性状进行相关性分析，结果（表3）表明，在低锌条件下，形态指标和生理指标及综合耐低锌能力系数（D）间达显著相关的有14对（P<0.05），呈极显著相关的有96对（P<0.01，下同）。其中在低锌条件下，株高、叶长、叶宽、叶面积、SPAD值、地上部鲜重、根系鲜重、根系干重、总根长、根系体积、干重根冠比与综合耐低锌能力系数（D）呈极显著负相关，相关系数分别为-0.22、-0.32、-0.27、-0.34、-0.27、-0.24、 -0.31、-0.36、-0.24、-0.23和-0.23。

2. 1. 3 水稻耐低锌性状的主成分分析、逐步回归分析及品种耐低锌能力预测 从相关系数矩阵（表3）可看出，生理指标间的相关信息存在重叠，同时各单项指标在水稻耐低锌中所起的作用也各不相同，直接利用这些指标不能准确评价各水稻品种的耐低锌能力。为综合评价水稻苗期的耐低锌能力，对144份供试种质材料形态和生理指标进行主成分分析，分析结果可将所有指标简化为8个新的综合指标，其贡献率分别为27.00%、15.37%、10.98%、6.82%、6.28%、5.82%、5.48%和4.66%，累积贡献率达82.41%，其余指标的贡献率忽略不计，将这8个新的综合指标定义为8个主成分。其中第一主成分根系表面积载荷系数绝对值较大，将该主成分归为根系表面积因子;第二主成分叶面积、叶宽和叶长载荷系数绝对值较大，将其归为叶面积因子;第三主成分干重根冠比和根系干重载荷系数绝对值较大，将其归为干重根冠比因子;第四主成分鲜重根冠比载荷系数绝对值较大，将其归为鲜重根冠比因子;第五主成分糙米锌含量载荷系数绝对值较大，将其归为种子糙米锌含量因子;第六主成分SPAD值载荷系数绝对值较大，将其归为叶绿素含量因子;第七主成分精米和糙米锌含量载荷系数绝对值较大，将其归为种子锌含量因子;第八主成分出叶数目载荷系数较大，将其归为出叶数目因子。上述结果表明，根系表面积、叶面积、干重根冠比、鲜重根冠比、糙米锌含量、叶绿素含量、种子锌含量和出叶数目与水稻苗期耐低锌能力有着直接关联性。

以综合耐低锌能力系数（D）为因变量、各单项指标的耐低锌系数（α）为自变量，建立最优回归方程：D=0.514+0.014X1+0.023X2+0.022X3+0.010X6+0.016X9+0.023X10+0.007X13+0.019X15+0.013X16+0.004X19。

式中，X1、X2、X3、X6、X9、X10、X13、X15、X16、X19分别代表株高、叶长、叶宽、SPAD值、根系鲜重、根系干重、根尖数、根系平均直径、鲜重根冠比及糙米锌含量为指标的耐低锌系数。相关系数r=0.9933，达极显著水平，表明这10个指标对水稻苗期和分蘖期耐低锌性有极显著影响。

2. 2 水稻种质资源耐低锌能力评价及水稻品系间、品系内耐低锌能力比较

2. 2. 1 水稻品系间耐低锌能力比较 种质资源遗传材料多样性丰富，由于参试品种中籼稻和AUS稻居多，综合考虑水稻生育期等因素，将其分为籼稻组、粳稻组、AUS组及其他品种4组进行分析。以欧式最长距离法，根据D进行聚类分析，对水稻耐低锌能力强弱进行分类，筛选耐低锌材料，在欧式距离0.17处，将各品系（种）耐低锌能力分为三类：D≤0.42，表示水稻耐低锌能力强;0.42≤D<0.59，表示水稻耐低锌能力一般;D≥0.59，表示水稻耐低锌能力差。聚类分析结果表明，144份种质资源中耐低锌能力强的有18份，占比12.5%;耐低锌能力中等的有92份，占比63.9%;耐低锌能力弱的有34份，占比23.6%。由图1可知，前两类中AUS品种的数量分别占本品系（种）的15.0%和70.0%，是4组中占比最高的品系;而在第三类中，AUS品种占比最低。籼稻在第一类中占比为12.5%，位居第二，但在低锌耐受能力最弱的第三类中占比21.9%。由此可见，各水稻品系间耐低锌能力差异明显，且由于各品系的起源不完全相同，因此需将各品系分开讨论，以期分别筛选出可在各起源地低锌地区正常生长的低锌耐受品系（种）。

2. 2. 2 AUS稻低锌耐受型及敏感型品种筛选与耐受能力评价 将所有AUS品种经主成分分析后得出综合耐低锌系数（D），以欧式最长距离法聚类，在0.08处可将20个AUS品种分为低锌耐受型强、较强、较弱和弱4类。由表5可知，在AUS品种中，在低锌条件下耐受型品种有EJ987、EJ523、EJ828、EJ16和EJ776，敏感型品种有EJ1103、EJ762、EJ83和EJ1017。

2. 2. 3 籼稻品系低锌耐受型及敏感型品种筛选与耐受能力评价 将所有籼稻品种经主成分分析后得到各籼稻品种的综合耐低锌系数（D），以欧式最长距离法聚类，在欧式距离0.19处可将64个籼稻品种分为低锌耐受型强、较强、较弱和弱4类。由表6可知，在籼稻品种中，在低锌条件下耐受型品种有EJ907、EJ108和EJ389，敏感型品种有EJ933、EJ56、EJ180、EJ167、EJ795、EJ199和EJ343。

2. 2. 4 粳稻低锌耐受型及敏感型品种筛选与耐受能力评价 将所有粳稻品种经主成分分析后得出综合耐低锌系数（D），以欧式最长距离法聚类，在欧式距离0.12处可将18个粳稻品种分为低锌耐受型强、较强、较弱和弱4类。由表7可见，在粳稻品种中，在低锌条件下耐受型品种有EJ886和EJ119，敏感型品种有EJ650、EJ887、EJ139、EJ866和EJ1019。

2. 2. 5 其他品种低锌耐受型及敏感型品种筛选与耐受能力评价 将其他品种经主成分分析后得出综合耐低锌系数（D），以欧式最长距离法聚类，在欧式距离0.10处可将42个其他水稻品种分为低锌耐受型强、较强、中等、较弱和弱5类。由表8可见，其他品种中，在低锌条件下耐受型品种有EJ586和EJ96，敏感型品种有EJ354、EJ415、EJ318和EJ309。

3 讨论

解决低锌对水稻产量的影响，不仅要科学施用锌肥，更重要的是筛选优质耐低锌水稻品种。采用统计学方法对水稻种质资源的表型性状和耐低锌能力进行鉴定与评价，可更高效地筛选耐低锌水稻品种。前人研究表明，水稻籽粒锌含量无论是品种间还是亚种间均存在极显著差异，且主要集中于种皮和胚中（梅忠等，2016）。本研究通过主成分分析和逐步回归分析，也发现水稻种子锌含量尤其是糙米中锌含量对苗期水稻耐低锌能力有显著影响。糙米锌含量与苗期水稻耐低锌能力显著相关，可能与种皮中锌含量较高有关。本研究还发现，低锌对水稻根系生长的影响尤为明显，与前人的研究结果（王人民等，2003a;Widodo et al.，2010;Lee et al.，2017）相似，原因可能是根系的变化可促使水稻植株进行更高效的养分吸收。逐步回归结果表明，株高、叶长、叶宽、SPAD值、根系鲜重、根系干重、根尖数、根系平均直径、鲜重根冠比及糙米锌含量可作为鉴定苗期水稻耐低锌能力的参考指标。

前人研究发现，籼稻中锌含量比粳稻高2倍（梅忠等，2016），而秈稻品系的生长环境中锌含量相对较低，因此耐低锌能力强的品种更易生存下来（Lee et al.，2017）。也就是说，籼稻亚种可能比粳稻亚种耐低锌能力更强。本研究通过对供试水稻品种的综合耐低锌系数（D）进行聚类分析，并与水稻各亚种间耐低锌能力进行对比分析，发现供试水稻各亚种间耐低锌能力顺序为AUS稻>籼稻>粳稻。究其原因可能与早前的半野生型稻种AUS稻生存环境较贫瘠，其植株体内可能存在某种较强的抵抗非生物胁迫（包括缺素）机制有关。

本研究发现，在AUS稻中，来自孟加拉国的AUS 299：：IRGC 29087-1和DV 86：：IRGC 8840-1，来自印度的KOTODESHI：：IRGC 60982-1、AUS PADDY（RED）：：IRGC 44978-1，以及AUS N22属于耐低锌能力强的品种。在籼稻中，来自韩国的DALSUNG 41、来自哥伦比亚的IRGA 659-1-2-2-2及UPR 191-66属于耐低锌能力强的品种。在粳稻中，来自法国的热带粳稻MEJANES 2和来自美国的温带粳稻ALEXANDROS属于耐低锌能力强的品种。

在进一步对粳稻耐低锌能力的分析中发现，供试的6种热带粳稻全部位于耐低锌能力较强的前3类，且在参试粳稻品种中，处在低锌耐受能力最弱的粳稻均为温带粳稻。可见，热带粳稻的低锌耐受能力较强。此外，发现来自我国的油占8号与籼粳CYPRESS：：G1-1也属于低锌耐受能力较强的品种。由于籼粳的杂种优势是近期的研究热点之一（左生力等，2019），该品种的筛选和利用可为其研究提供参考。本研究结果筛选出的耐低锌品种结合基因组数据，在后续研究中可进行高可信度的锌元素吸收转运的QTL定位及水稻耐低锌能力相关基因变异群体的构建。

4 结论

株高、叶长、叶宽、叶绿素含量、地下部鲜重、地下部干重、根尖数、根系平均直径、鲜重根冠比和糙米锌含量可作为水稻耐低锌能力的筛选指标。在土壤锌含量低的区域种植水稻时，可增加对AUS 299：：IRGC 29087-1、N22、KOTODESHI：：IRGC 60982-1、AUS PADDY（RED）：：IRGC 44978-1、DV 86：：IRGC 8840-1、DALSUNG 41、IRGA 659-1-2-2-2、UPR 191-66、MEJANES 2、ALEXANDROS、油占8号和CYPRESS：：G1-1等12份耐低锌品种的推广和利用。

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（責任编辑 王 晖）