3D打印纳米纤维/藻酸盐基水凝胶的制备与表征

魏佳欣，洪永修，王宝秀，陈仕艳*

(1. 东华大学材料科学与工程学院，纤维材料改性国家重点实验室，上海 201620； 2. 上海奕方农业科技股份有限公司，上海 201607)

三维(3D)打印是一种新兴的生物制造方法，可在指定的3D层次组织中精准定位生物制剂，从而创建人造的多细胞组织/器官。现已经使用几种3D打印方法成功地进行了生物打印各种组织构建体，以模仿天然组织和器官(如皮肤、软骨、肝、肺和神经等)[1]。

组织修复用材料需要模仿细胞外基质(ECM)，从而发挥功能并促进新组织的形成，其主要成分是胶原纤维和蛋白多糖[2]。水凝胶是具有亲水性交联三维聚合物网络的材料，因具有类似于天然细胞外基质的高水含量和理化特性而具有高度的生物相容性，适合于人造皮肤[3]、组织工程[4]、药物递送等生物医用领域[2-5]，是一种有前景的生物材料。多糖之一的藻酸盐，因其生物相容性、低成本以及易实现的交联条件，是3D打印油墨中常见的选择。但存在细胞粘附弱和机械性能差的问题，通常与其他生物聚合物混合进行改善。细菌纤维素(BC)是一种由木醋杆菌合成的结晶胞外多糖，由于强大的氢键作用和高度结晶性而具有出色的机械性能[6]。鉴于与胶原纤维的形态相似性，BC与细胞具有正相互作用，促进细胞命运过程[6-7]，并且纳米纤维素的增强机理与天然组织相似。在3D打印方面，纳米纤维素表现出的优异的流变行为，这有助于油墨的挤出并在打印后保持3D结构的自支撑和打印形状[8]。

本文研究了TOBC对藻酸盐基水凝胶的微观形貌、压缩、溶胀等性能的影响。通过改变TOBC和SA的比例，探索了TOBC对水凝胶油墨流变行为的影响。并以此为理论基础，研究了水凝胶油墨流变行为与3D打印之间关系，探讨加工参数对打印线条的分辨率的影响以及打印结构可控的水凝胶通孔支架的可能性，并进一步评估水凝胶的细胞相容性，为生物医用材料领域提供新的可3D打印材料与研究基础。

1 试 验

1.1 试验药品与仪器

海藻酸钠，分析纯，国药集团化学试剂公司；乙二胺四乙酸钙二钠盐(EDTA-Ca)，分析纯，国药集团化学试剂公司；氯化钙，分析纯，国药集团化学试剂公司；葡萄糖酸内酯(GDL)，RG,阿达玛斯试剂公司；DMEM培养基，Hyclone公司；胰酶，Life Technologie；(CCK-8) 试剂盒，日本同仁化学研究所；LIVE/DEAD 试剂盒，上海翔升生物科技公司。TOBC和注射级超纯水为实验室自制。

美国Instron 公司Instron5969电子万能材料试验机，日本Hitach公司场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)，美国Harvard Apparatus公司Pump 11 Elite注射泵，天威PrintRite公司CoLiDo DIY 3D打印机，美国Thermo Fisher公司Nicolet 6700红外光谱(ATR-FTIR)，瑞士Tecan公司Infinite F50酶标仪，德国Leica TCS SP5Ⅱ激光共聚焦显微镜。

1.2 制备过程

称取一定量的SA溶于超纯水，制备质量分数5%(%为质量分数，下同)的SA溶液。基于课题组之前的文献[9]，制备TEMPO氧化细菌纤维素。

水凝胶油墨及样品的制备：具体配比见表1，将一定量TOBC加入SA溶液中，并加入一定量的EDTA-Ca，进行搅拌均匀。然后加入一定量的GDL使EDTA-Ca释放钙离子从而预交联8 h，存放于4℃下备用。后续在室温下置于1%氯化钙溶液中进行，补充交联60 min以稳定水凝胶。

表1 样品配方数据表

SA+TOBC是总固含量，(SA+TOBC)含量指SA与TOBC在油墨中的含量，TOBC含量是TOBC占总固含量的比例。

1.3 测试与表征

红外光谱测试：采用ATR-FTIR分析样品的化学结构。将样品用超纯水洗涤后进行冷冻干燥，设定波长范围为4 000～600 cm-1，分辨率为2 cm-1。

微观结构表征：采用FE-SEM对冻干支架的微观形貌进行表征。

压缩性能测试：采用万能材料试验机测量水凝胶压缩性能，设定为压缩速率10 mm/min，最大压缩量为40%。

油墨的流变性能测试：稳态流动测试中剪切速率的测试范围为0.01～1 000 s-1。触变测试包括三个步骤：在步骤Ⅰ中，施加0.1 s-1的剪切速率60 s；在步骤Ⅱ中，剪切速率增加到300 s-1并保持10 s；在步骤Ⅲ中，将剪切速率降低至0.1 s-1并保持50 s。在满足线性粘弹性区域(LVR)的临界应时，选择0.01%应变振幅，频率扫描范围为0.1～100 rad/s，得到储能模量(G′)、损耗模量(G″)随频率的曲线。

3D打印测试：使用改造过的基于挤出的3D打印系统。挤出体积流量通过注射泵调节，打印速度和印刷结构等参数在G代码中调整。除非另有说明，印刷过程在室温下进行，使用22 G(内径0.41 mm)圆柱形钢尖来印刷。

细胞相容性测试：在37℃、95%湿度和5% CO2的二氧化碳细胞培养箱中培养L929成纤维细胞。待细胞传代至所需数量时，定量地种植在水凝胶支架材料上。采用CCK-8测定细胞探究其在不同水凝胶支架上的增殖能力。采用Live/Dead染色法，直观观察细胞在水凝胶支架上的生长活性。通过SEM观察细胞在水凝胶支架上的生长形貌。

2 结果与讨论

2.1 水凝胶油墨的红外光谱与微观结构

如图1所示，纯SA水凝胶的多糖结构的特征峰出现在1 306，1 080和1 026 cm-1，对应于C-O，C-C和C-O-C伸缩振动吸收峰[10- 12]。当TOBC与SA(4ST50)混合时，大多数特征峰彼此重叠，其-COO不对称和对称的特征吸收峰分别为1 598 cm-1和1 424 cm-1，介于纯TOBC(1 605 cm-1，1 427 cm-1)和SA(1 591 cm-1，1 417 cm-1)之间，这可能是由于TOBC的羧基与相邻的SA分子之间形成的交联网络。图2显示了冷冻干燥的TOBC/SA复合水凝胶的SEM图像，可以看出，水凝胶网络是多孔的微观结构，随着TOBC含量的增加，孔径越小，这可能是由于TOBC与SA侧链的官能团之间的氢键相互作用使交联密度增加的原因。

图1 4ST0、4ST50和TOBC的FTIR谱图

图2 纳米复合水凝胶截面形貌的FE-SEM图(a) 4ST0; (b) 4ST30; (c) 4ST50; (d) 4ST70

2.2 水凝胶油墨的流变行为

图3显示了不同TOBC含量的油墨的黏度曲线，呈现出油墨的稳定以及切力变稀行为。对黏度曲线进行幂律方程的线性拟合以及公式的推导得到的数据见表2。从表中可以看出，随着TOBC含量从0增加至30%、50%、70%，幂律指数n从0.26下降为0.22、0.17和0.15。这表明随着TOBC含量的增加，油墨的非牛顿性越突出，对剪切速率越敏感。因此，可通过改变剪切速率来改变黏度进而加工。随着TOBC含量从0增加至70%，喷嘴内壁的最大剪切速率从210.8 s-1依次增加至232.3、273.5和297.6 s-1。这是因为较高TOBC含量的油墨，对剪切力较为敏感，在喷嘴内壁显示较低黏度，所以较快的被挤出，进而在喷嘴内壁的剪切速率较大。

图3 不同TOBC含量的水凝胶油墨的黏度曲线

表2 不同TOBC含量的水凝胶油墨的与流动行为相关的拟合参数

图4 不同TOBC含量的水凝胶油墨的触变与恢复曲线

从表2可看出该体系油墨在喷嘴处的最大剪切速率约为200～300 s-1，故设定300 s-1为触变实验中高剪切速率。从图4可看出，挤出过程中(4ST0)水凝胶油墨的初始黏度为1 050 Pa·s，当剪切速率增加到300 s-1时，黏度急剧下降到2.02 Pa·s，油墨表现得更像液体。在剪切速率突然降低至0.1 s-1后，黏度立即增加至428 Pa·s，这种触变特性有利于挤出沉积的图案印刷保持其形状和结构。选择恢复低剪切速率后30 s时的黏度恢复程度作为对比，如表2所示，随着TOBC含量的增加至30%、50%和70%，恢复程度从41%先升高至83%，后下降到63%。由此我们可以看出，TOBC的加入明显提高油墨的触变行为，其中4ST50的触变性最高，具有83%的触变恢复率。

油墨的所得G′和G″和频率的关系见图5，从图中可看出，油墨的G′和G″几乎与频率无关，无溶胶-凝胶转变，表现出结构稳定性，并且G′总是大于G″，表现出类固体行为，有利于非原位打印的构建体结构的维持，为打印提供了现实的指导意义。

2.3 水凝胶油墨3D打印

图6给出了不同TOBC含量的水凝胶油墨的细丝线宽的情况。因为纯SA油墨不能连续挤出，故未进行后续打印实验。从图中可以看出，TOBC含量从30%增加至50%和70%，细丝线宽从(724±34)μm，降低至(622±34)μm和(546±38)μm。这说明细丝线线宽随着TOBC含量的增加而减少。结合流变实验，我们认为可能是TOBC增加了油墨的非牛顿行为，使其在喷嘴处的剪切细化，沉积后由于油墨的高度结构化，能维持打印形状。随着TOBC的含量增加，非牛顿行为和结构化程度都有所增加，故70% TOBC含量的油墨具有最小线宽。

图6 不同TOBC含量对纳米复合水凝胶油墨挤出细丝线宽的影响(比例尺:100 μm)

除了油墨组分的影响，细丝的打印连续性和线分辨率是构造3D结构的一个重要参数。打印速度即是喷嘴的移动速度Vxy对4ST50细丝线宽影响如图7所示，随着Vxy从3 mm/s增加至4 mm/s，细丝线宽从(834±18)μm至(632±18)μm，明显减小。但当Vxy进一步增加至5和6 mm/s，细丝线宽变化不明显，超过6 mm/s时，细丝就不能连续打印。这是由于喷嘴移动带动的牵引效应，细丝将被拉伸并变得更细，细丝线宽随着Vxy的增加而减小，但是当Vxy太高时，细丝被破坏，出现了非连续打印。结合连续印刷实验和文献[13]和实际打印的细丝线宽，本文采用4 mm/s的打印速度。

图7 打印速度Vxy对细丝线宽的影响

3D生物打印的主要目标之一是打印复杂的器官或器官系统。然而，目前的生物材料缺乏机械强度以及印刷较大的中尺度结构的可印刷性。为了证明TOBC/SA复合水凝胶油墨能够以高形状保真度印刷复杂形状，我们印刷了多种内外可控的结构，如高达2 cm的圆柱、耳朵、鼻子等，见图8。

图8 4ST50油墨印刷结构的拍摄图(a) 圆柱；(b) 耳朵；(c) 鼻子

2.4 压缩强度

图9给出了不同TOBC含量的纳米复合水凝胶的压缩强度。从图中可以看出，随着TOBC含量从0%依次增加至30%、50%和70%，压缩强度从(102.2±12.6)kPa增加至(125.4±12.2)kPa、(260.9±16.2)kPa、(243.4±10.6)kPa，呈现先增加后减少的趋势。这表明适量的TOBC可提高水凝胶的压缩强度，50%含量的TOBC使压缩性能最优。TOBC机械增强效果显著的主要原因在于：TOBC是一种亲水性能良好的纳米纤维[6]，具有高结晶度的纳米纤维分布在水凝胶孔壁和内部，增加能量耗散，赋予了其较高的机械性能。此外丰富的羟基可以形成大量氢键，增强水凝胶的力学性能。

图9 不同TOBC含量的纳米复合水凝胶的压缩强度

2.5 细胞增殖与活性分析

图10给出了L929细胞在4ST0和4ST50水凝胶支架上的增殖情况。随着培养时间的增加，细胞都表现出增殖的趋势，并且生长状态良好。在第1天，观察到4ST50与4ST0增殖没有显著差异。在第3天，4ST50上的细胞数量显著高于4ST0。图11(a，b)是水凝胶支架上培养3天的细胞的Live/Dead染色图，可发现这些支架上的活细胞紧密相聚，几乎观察不到死细胞。与4ST0相比，含有TOBC的4ST50上有更多的细胞并表现出铺展的形态。图11(c，d)给出了细胞在支架上的粘附情况和形态的SEM图，与4ST0相比，细胞在4ST50支架上完全伸展，呈现长梭形的形态。这说明TOBC纳米纤维有利于细胞粘附，进而增强细胞与支架的相互作用，促进细胞的伸展。此外，从图11(d)可明显看出4ST50水凝胶表面的微纳米级粗糙度，有利于细胞相互作用和细胞外基质的产生，并且这种粗糙的表面有利于营养物供应和废物去除的扩散速率，提高细胞的代谢[14]。

图10 在不同纳米复合水凝胶上L929细胞的增殖情况

图11 Live/Dead细胞染色图和SEM细胞形貌图(a，b)4ST0；(c，d)4ST50

3 结 论

本文以TOBC作为增强体，制备了不同比例的TOBC/SA纳米复合水凝胶材料，研究了其流变行为和3D打印的可行性，并利用3D打印的方法打印了不同形状并具有高结构稳定性的水凝胶支架。这种能够通过3D打印控制其内外宏观结构以满足组织对孔径和外观结构，并具有纳米纤维模拟天然细胞外基质的支架材料，有望作为组织工程修复的移植物，在组织工程支架领域具有潜在的应用前景。