余甘子叶总黄酮的超声波法提取工艺优化及其抗氧化能力研究

杜丽娟 - 苏秀芳 - 黄成银 -

(1.广西民族师范学院生物与食品工程学院，广西 崇左 532200；2.广西高校桂西南特色植物资源化学重点实验室培育基地，广西 崇左 532200)

余甘子(PhyllanthusemblicaL.)为大戟科叶下珠属植物，广泛分布于广东、广西、云南等[1]。余甘子营养丰富，是一种难得的食药两用物质，被联合国卫生组织指定为在世界范围内推广种植的3种保健植物之一[2]。目前，余甘子果实的研究主要集中于黄酮、单宁等物质的提取[3]；抗氧化、护肝[4]、防癌[5]等功能性的评价；果酒[6]、果醋[7]、含片等功能性食品或药品的研究开发。张伦等[8]对比了余甘子树枝、树皮、树叶等组织原花色素的质量浓度及抗氧化能力，李舒等[9-10]测定了余甘子叶总黄酮含量，并分析了其药理作用机理，有关余甘子叶总黄酮提取工艺及抗氧化能力的研究尚未见报道。

黄酮是一大类化合物的总称，其在植物中的含量因植物品种差异较大[11]。黄酮具有多种功效，如抗氧化、抗炎、降血糖等作用[12]。Tung等[13]发现余甘子对非酒精性脂肪肝炎具有一定的保护作用，可能与其活性物质黄酮成分密切相关。常用的黄酮提取技术有微波辅助法、乙醇回流法和超声提取法等[14]。微波辅助法快速高效，但产热不均匀，易出现局部位置温度高，破坏有效成分[15]；乙醇回流法是传统提取方法，简单易操作，但提取时间长，产率低[16]；超声提取法有助于细胞内物质更好地溶出，具有提取率高、时间短的特点[17-18]。试验拟以余甘子叶为原料，采用超声法提取总黄酮并分析其抗氧化能力，以期为余甘子叶的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

余甘子叶：广西民族师范学院；

芦丁：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

DPPH：纯度≥97%，上海蓝季科技发展有限公司；

亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、95%乙醇、30%过氧化氢、水杨酸、抗坏血酸、石油醚、柠檬酸、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、磷酸氢二钠、七水合硫酸亚铁等：分析纯。

1.1.2 仪器与设备

可见分光光度计：VIS-722N型，北京瑞利分析仪器公司；

数控超声波清洗仪：SG1200HE型，上海冠特超声仪器有限公司；

电热鼓风干燥箱：SG1200HE型，北京市永光明医疗仪器有限公司；

分析天平：AR124CN型，奥豪斯仪器(上海)有限公司；

高速万能粉碎机：FW100型，天津市泰斯特仪器有限公司；

循环水式多用真空泵：SHZ-D(Ⅲ)型，河南省予华仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 余甘子叶预处理 根据文献[19]修改如下：取完好无损的余甘子叶片，用自来水清洗3次，再用蒸馏水洗净，阴凉处自然沥干，60 ℃恒温烘箱中烘至恒重，粉碎，粉末置于1 000 mL锥形瓶中，按料液比1∶30(g/mL)加入沸程为60～90 ℃的石油醚，搅拌混合，除色除脂(3次)，过滤。将脱色脱脂的余甘子叶粉末烘干备用。

1.2.2 余甘子叶总黄酮得率的测定

(1)标准曲线的绘制：准确称取0.020 0 g芦丁标准品，用50%乙醇溶解转移至50 mL容量瓶并定容。用移液管分别吸取0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL于25 mL的比色管中，然后依次加入5% NaNO2溶液0.40 mL、10% Al(NO3)3溶液0.40 mL、4% NaOH溶液5 mL，每次加入试剂后摇匀静置6 min，并定容至25 mL，于510 nm处测定吸光值。得曲线方程y=10.986x-0.002 7，R2= 0.999 8。

(2)余甘子叶总黄酮含量的计算：称取0.500 0 g余甘子叶粉末，置于锥形瓶中并加入适量的50%乙醇，摇匀后密封，特定条件下进行提取，抽滤，将滤液定容于100 mL容量瓶。取1.00 mL提取液于25 mL容量瓶中，按1.2.2(1)添加试剂，于510 nm处测定吸光值。采用50%乙醇溶液为空白对照，并按式(1)计算总黄酮得率。

(1)

式中：

F——总黄酮得率，%；

C——总黄酮浓度，mg/mL；

V——样品溶液体积，mL；

X——稀释倍数；

M——余甘子叶粉末质量，mg。

1.2.3 单因素试验

(1)料液比：在乙醇浓度50%、超声功率50 W、提取时间20 min，提取温度50 ℃下，考察料液比[1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35(g/mL)]对总黄酮得率的影响。

(2)乙醇浓度：在料液比1∶25(g/mL)、超声功率50 W、提取温度50 ℃，提取时间20 min下，考察乙醇浓度(30%，40%，50%，60%，70%)对总黄酮得率的影响。

(3)超声功率：在料液比1∶25(g/mL)、乙醇浓度50%、提取温度50 ℃，提取时间20 min下，考察超声功率(30，40，50，60，70 W)对总黄酮得率的影响。

(4)提取温度：在料液比1∶25(g/mL)、乙醇浓度50%、超声功率60 W，提取时间20 min下，考察提取温度(30，40，50，60，70 ℃)对总黄酮得率的影响。

(5)提取时间：在料液比1∶25(g/mL)、乙醇浓度50%、超声功率60 W，提取温度60 ℃下，考察提取时间(10，20，30，40，50 min)对总黄酮得率的影响。

1.2.4 抗氧化能力

(1)对·OH清除能力的测定：根据文献[20]修改如下：依次移取不同浓度的余甘子叶总黄酮提取液(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL)2.0 mL、9.9 mmol /L水杨酸1.0 mL、9.9 mmol/L FeSO4·7H2O溶液1.0 mL、8.8 mmol/L H2O2溶液1.0 mL放入比色管中，摇匀，37 ℃水浴30 min，于510 nm处测定吸光值。以蒸馏水代替H2O2为对照组，以蒸馏水代替余甘子叶总黄酮提取液为空白组测定吸光值，以抗坏血酸(VC)为阳性对照，按式(2)计算·OH清除率。

(2)

式中：

C——·OH清除率，%；

A1——样液组吸光值；

A2——对照组吸光值；

A0——空白组吸光值。

(2)对DPPH·清除能力的测定：根据文献[21]，修改如下：依次移取不同浓度的余甘子叶总黄酮提取液(0.01，0.02，0.04，0.06，0.08 mg/mL)2.0 mL、0.25 mmol/L DPPH—乙醇溶液2.0 mL放入比色管中，暗处反应30 min，于517 nm处测吸光值；以无水乙醇为对照，抗坏血酸(VC)为阳性对照，并按式(3)计算DPPH·清除率。

(3)

式中：

C——DPPH·清除率，%；

A1——样液与DPPH混合后的吸光值；

A2——样液与乙醇混合后的吸光值；

A0——DPPH与乙醇混合后的吸光值。

(3)对NaNO2清除能力的测定：根据文献[22]修改如下：依次移取不同浓度的余甘子叶总黄酮提取液(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 μg/mL)2.0 mL，5 μg/mL NaNO2溶液2.0 mL及pH=3的柠檬酸—盐酸缓冲液3.0 mL放入比色管中，37 ℃水浴1 h，冷却，加入0.4%对氨基苯磺酸2.0 mL，5 min后再加入0.2%盐酸萘乙二胺1.0 mL，静置15 min，于540 nm处测定吸光值。以60%乙醇为空白对照，抗坏血酸(VC)为阳性对照，按式(4)计算NaNO2清除率。

(4)

式中：

C——NaNO2清除率，%；

A0——样液组吸光值；

A——对照组吸光值。

1.3 数据处理

所有数据测定3次，取均值，采用 Origin 8.5、SPSS 19.0软件进行绘制和数据处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对余甘子叶总黄酮得率的影响 由图1可知，余甘子叶总黄酮物质得率随料液比的增加先增加后减小，当料液比为1∶25(g/mL)时达最大值(13.91%)。因此，最适料液比为1∶25(g/mL)。

2.1.2 乙醇浓度对余甘子叶总黄酮得率的影响 由图2可知，余甘子叶总黄酮物质得率随乙醇浓度的增大先上升后下降，当乙醇浓度为50%时达最大值(13.91%)。因此，最适乙醇浓度为50%。

图1 料液比对余甘子叶总黄酮得率的影响

Figure 1 Effect of material and liquid ratio on the yield of total flavonoids fromphyllanthusemblica’sleaves

图2 乙醇浓度对余甘子叶总黄酮得率的影响

Figure 2 Effect of ethanol volume fraction on the yield of total flavonoids fromphyllanthusemblica’sleaves

2.1.3 超声功率对余甘子叶总黄酮得率的影响 由图3可知，余甘子叶总黄酮物质得率随超声功率的增大先上升后下降。当超声功率为60 W时，得率高达13.97%。超声功率越大，破坏细胞壁的能力就越强，因此余甘子叶总黄酮物质的浸出就越多；但超声功率过大，“空化作用”过强，在一定程度会破坏一些黄酮物质的结构，影响总黄酮得率。与苏适等[23]的研究结果类似。因此，超声功率60 W最为合适。

2.1.4 提取温度对余甘子叶总黄酮得率的影响 由图4可知，余甘子叶总黄酮得率随提取温度的升高先增加后减小，当提取温度为60 ℃时得率最大，为14.11%。适宜的温度能促使溶剂分子加快运动，有利于总黄酮物质的溶解；温度过高，乙醇挥发加剧，同时高温导致部分不稳定的黄酮类成分发生分解反应，使得余甘子叶总黄酮得率下降，与杨丽维等[24-25]的研究结果一致。因此，提取温度选择60 ℃最为合适。

2.1.5 提取时间对余甘子叶总黄酮得率的影响 由图5可知，余甘子叶总黄酮物质得率随提取时间的延长先上升后下降。当提取时间为20 min时得率最大，为13.85%。说明超声提取能在较短的时间里将余甘子叶总黄酮提取较为完全，提取时间越长，余甘子叶的其他活性成分也开始溶出，在一定程度上抑制了黄酮物质的溶出，同时，长时间的加热和超声使已溶出的黄酮物质水解或氧化，从而降低余甘子叶总黄酮得率。因此，提取时间选择20 min最为合适。

图3 超声功率对余甘子叶总黄酮得率的影响

Figure 3 Effect of ultrasonic power on the yield of total flavonoids fromphyllanthusemblica’sleaves

图4 提取温度对余甘子叶总黄酮得率的影响

Figure 4 Effect of extract temperature on the yield of total flavonoids fromphyllanthusemblica’sleaves

图5 提取时间对余甘子叶总黄酮得率的影响

Figure 5 Effect of extract time on the yield of total flavonoids fromphyllanthusemblica’sleaves

2.2 正交试验

根据单因素试验结果，在最佳提取温度60 ℃下，选取料液比、乙醇浓度、超声功率、提取时间进行四因素三水平正交试验设计，因素水平表见表1，试验结果见表2。

表1 正交试验因素水平表

表2 余甘子叶总黄酮提取正交试验结果

Table 2 Results of orthogonal experiment on extraction of total flavonoids fromphyllanthusemblica’sleaves

试验号ABCD总黄酮得率/%1111112.8212122213.9133133314.0954212313.5955223113.7316231214.3687313213.1858321313.4589332113.048k113.61013.20013.54913.200 k213.89813.70113.51913.822k313.23013.83713.67013.716R0.6680.6370.1510.622

由表2可知，各因素对余甘子叶总黄酮得率的影响大小依次为乙醇浓度>料液比>提取时间>超声功率。由表3可知，料液比、乙醇浓度、提取时间对余甘子叶总黄酮的得率有显著影响，而超声功率无显著影响。根据正交试验结果，余甘子叶总黄酮的最佳提取工艺为A2B3C3D2，即料液比1∶25(g/mL)、乙醇浓度60%、超声功率70 W、提取时间20 min、提取温度60 ℃。对最佳提取工艺进行验证(n=3)，余甘子叶总黄酮得率为14.565%，RSD值为0.476%，说明通过正交试验得到的最佳工艺条件稳定可靠。

表3 正交试验结果方差分析†

†F0.05(2,8)=4.46，F0.01(2,8)=8.62；*表示影响显著(P<0.05)，**表示影响极显著(P<0.01)。

2.3 余甘子叶总黄酮的抗氧化能力

2.3.1 对·OH的清除能力 由图6可知，当余甘子叶总黄酮浓度为0.5 mg/mL时，清除率可达82.72%，此时的VC清除率为99.14%，说明余甘子叶总黄酮在较大浓度时具有很强的清除·OH的能力。

2.3.2 对DPPH·的清除能力 由图7可知，当样品浓度为0.08 mg/mL时，余甘子叶总黄酮和VC对DPPH·清除率分别为97.40%，97.58%，说明余甘子叶总黄酮具有很强的清除DPPH·的能力。

图6 余甘子叶总黄酮对·OH的清除能力

Figure 6 The ·OH scavenging ability of total flavonoids in the leaves ofphyllanthusemblica

图7 余甘子叶总黄酮对DPPH·的清除能力

Figure 7 The DPPH· scavenging ability of of total flavonoids in the leaves ofphyllanthusemblica

2.3.3 对NaNO2的清除能力 由图8可知，当样品浓度为0.5 mg/mL时，余甘子叶黄酮提取液和VC对亚硝酸钠的清除率分别为66.14%，94.65%，说明余甘子叶黄酮具有一定的清除亚硝酸钠的能力，但清除能力低于VC。

图8 余甘子叶总黄酮对亚硝酸盐的清除能力

Figure 8 The NaNO2scavenging ability of of total flavonoids in the leaves ofphyllanthusemblica

3 结论

余甘子叶总黄酮的最佳提取工艺为料液比1∶25(g/mL)、乙醇浓度60%、超声功率70 W、提取时间20 min、提取温度60 ℃，此时提取率最大为14.57%。余甘子叶总黄酮对·OH、DPPH·以及NaNO2均具有一定的清除能力，当余甘子总黄酮提取液的质量浓度为0.5 mg/mL时，对·OH和NaNO2的清除率分别为82.72%，66.14%，当余甘子总黄酮提取液的质量浓度为0.8 mg/mL时，对DPPH·的清除率为97.40%，表明余甘子叶总黄酮具有较强的抗氧化能力。后续可对余甘子叶总黄酮进行进一步分离纯化鉴定，确定单体并分析其功效作用，建立余甘子叶保健产品与黄酮活性成分的量效关系。