黑水虻幼虫蛋白水解物的制备及营养价值评价

朱 定，王存文，杨 芳*

(1.武汉工程大学环境生态与生物工程学院，湖北 武汉 430205；2.武汉工程大学化工与制药学院，湖北 武汉 430205)

黑水虻(HermetiaillucensL.)是一种原产于美洲、现广泛分布于全球热带和温带地区的双翅目昆虫[1-2]。据报道，黑水虻幼虫以各种各样的有机材料为食，将其高效地转化为优质昆虫蛋白，并已被用于小规模废物处理，黑水虻幼虫可食用的基质包括稻草[3]、食物垃圾[4]、酒糟[5]、粪便污泥[6-7]、动物内脏以及厨余垃圾等[8]。大量研究表明，蛋白质经蛋白酶水解后不仅便于生物体对其消化吸收，且水解产生的肽类还具有多种生物活性，如抗氧化、抗菌、抗炎、降血压及增强免疫力等[9]。目前，关于黑水虻幼虫的研究主要集中在饲料[10]、生物柴油[11]以及抗菌肽[12]的开发等方面，对黑水虻幼虫蛋白水解物氨基酸组成和营养价值评价的研究却鲜有报道。

作者在制备黑水虻幼虫蛋白的基础上，选择含量和得率相对较高的蛋白，通过碱性蛋白酶对其进行水解；并采用超滤方法将其蛋白水解物分为<3 kDa、3～10 kDa、>10 kDa等3种组分，通过氨基酸自动分析仪测定各组分的氨基酸组成，采用必需氨基酸比值(essential amino acid index，EAAI)、氨基酸比值(ratio of amino acid，RAA)以及氨基酸比值系数(ration coefficient of amino acid，RC)等营养学方法对其进行营养价值评价，为黑水虻幼虫蛋白资源的综合利用提供一定的参考依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

黑水虻幼虫，湖北志民农业科技有限公司。

碱性蛋白酶Alcalase 2.4 L，诺维信(中国)生物技术有限公司；超滤管，Millipore公司；透析袋，上海源叶生物科技有限公司；氢氧化钠、石油醚、乙醇、浓盐酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

Hitachi835-50型氨基酸自动分析仪，日本Hitachi公司；84-1A6型恒温磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司；SCIENTZ-10N型冷冻干燥机、XHF-DY型高速离心机，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 黑水虻幼虫蛋白的制备

采用石油醚法[13]对黑水虻幼虫进行脱脂。将黑水虻幼虫洗净，50 ℃烘干，粉碎；取10 g虫粉，加入20 mL石油醚，于磁力搅拌器上搅拌1 h；倒出含有脂肪的溶剂，过滤回收，得石油醚脱脂虫粉。

压榨脱脂虫粉由普罗欧生物科技(武汉)有限公司提供。

按照许彦腾[14]方法提取脱脂虫粉中的粗蛋白。取10 g脱脂虫粉，加入220 mL 24.4 g·L-1的NaOH溶液，在53.2 ℃、200 r·min-1摇床反应2 h；将反应液于8 000 r·min-1离心30 min；收集上清液，用1 mol·L-1盐酸调节pH值至蛋白质等电点(4.8)，再次离心；收集沉淀，用去离子水复溶，并用0.1 mol·L-1的NaOH溶液调节至中性；将得到的盐溶液转移至透析袋中，于1 000 mL去离子水中4 ℃静置透析48 h；将透析液于50 ℃、200 r·min-1旋转蒸发浓缩，冷冻干燥48 h，最终得到干燥的黑水虻幼虫粗蛋白，置于4 ℃冰箱中保存，备用。

采用醇洗法对黑水虻幼虫粗蛋白进一步精制。取黑水虻幼虫粗蛋白，按固液比1∶10(g∶mL，下同)加入95%的乙醇，洗脱15 min，60 ℃烘干至恒重，得黑水虻幼虫精制蛋白。采用凯氏定氮法测定蛋白含量，按式(1)计算蛋白得率：

(1)

1.3 黑水虻幼虫蛋白的水解和分级

取2 g黑水虻幼虫蛋白溶解于100 mL蒸馏水中，调节pH值至8.0，加入40 mg碱性蛋白酶Alcalase 2.4 L，55 ℃摇床反应4 h；沸水浴10 min，灭酶；将蛋白水解液于8 000 r·min-1离心10 min；收集上清，依次通过10 kDa、3 kDa超滤管，分别得到<3 kDa、3～10 kDa、>10 kDa等3种不同分子量的超滤组分；冷冻干燥，-20 ℃保存，备用。分别按式(2)、(3)计算蛋白产率和蛋白回收率[15]：

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(3)

1.4 氨基酸含量的测定

黑水虻幼虫蛋白水解物及其超滤组分的氨基酸组成按Yang等[16]的方法测定。样品经6 mol·L-1盐酸水解后使用氨基酸自动分析仪进行分析；含硫氨基酸、胱氨酸和蛋氨酸的含量在甲酸预水解后测定；色氨酸的含量在碱性水解后测定。

1.5 黑水虻幼虫蛋白水解物的营养价值评价

根据氨基酸组成情况，分别计算黑水虻幼虫蛋白水解物及其超滤组分的必需氨基酸(essential amino acid，EAA)、非必需氨基酸(non-essential amino acid，NEAA)、总氨基酸(total amino acid，TAA)含量和EAA/NEAA值；并根据氨基酸比值系数法[17]，将黑水虻幼虫蛋白水解物及其超滤组分中氨基酸组成与联合国粮食及农业组织/世界卫生组织(FAO/WHO)中的人体必需氨基酸模式进行对比，分别按式(4)、(5)、(6)计算EAAI[18]、RAA、RC[19]，评价黑水虻幼虫蛋白水解物及其超滤组分的营养价值。

(4)

(5)

(6)

式中：n为氨基酸个数，n≤8；an为实验中必需氨基酸的含量，g·(100 g蛋白质)-1；bn为FAO/WHO标准中对应必需氨基酸的含量，g·(100 g蛋白质)-1。

2 结果与讨论

2.1 脱脂方法对黑水虻幼虫的蛋白含量和得率的影响

黑水虻幼虫分别经石油醚法和压榨法脱脂后，再经碱提酸沉法提取粗蛋白以及醇洗法精制蛋白，各步骤的蛋白含量与蛋白得率见表1。

表1黑水虻幼虫的蛋白含量与蛋白得率/%

Tab.1 Protein content and protein yield of black soldier fly larvae/%

石油醚法蛋白含量蛋白得率压榨法蛋白含量蛋白得率脱脂虫粉53.01±0.44a———40.27±0.09a———粗蛋白粉63.16±0.27b46.02±0.43b69.53±0.18b42.31±0.67b精制蛋白粉80.75±0.18c92.18±0.75c82.91±0.18c89.43±0.32c

注：同一列中不同小写字母(a、b、c)表示差异显著(P<0.05)。

由表1可知，采用石油醚法和压榨法两种脱脂方法得到的脱脂虫粉的蛋白含量分别为(53.01±0.44)%和(40.27±0.09)%；两种脱脂虫粉在经过碱提酸沉法和醇洗法后，精制蛋白粉的蛋白含量均显著提高，其中压榨法脱脂得到的精制蛋白粉含量最高，达到了(82.91±0.18)%。因此，选择压榨法对黑水虻幼虫蛋白进行脱脂。

2.2 黑水虻幼虫蛋白水解物及其超滤组分的蛋白产率与蛋白回收率

黑水虻幼虫蛋白能被碱性蛋白酶有效水解成小分子多肽，从而有利于机体吸收，其相关产品的产率和回收率影响到工业生产成本。黑水虻幼虫蛋白水解物及其超滤组分的蛋白产率与蛋白回收率如图1所示。

由图1可知，黑水虻幼虫蛋白水解物的蛋白产率和蛋白回收率分别为93.46%和85.47%；在超滤组分中，<3 kDa组分的蛋白产率和蛋白回收率最高，分别为63.41%和54.39%；>10 kDa组分的蛋白产率和蛋白回收率最低，分别为10.11%和7.95%。

图1 黑水虻幼虫蛋白水解物及其超滤组分的蛋白产率与蛋白回收率Fig.1 Protein yield and protein recovery of black soldier fly larvae protein hydrolysates and their ultrafiltration fractions

2.3 黑水虻幼虫蛋白水解物及其超滤组分的氨基酸组成

从营养学角度来说，蛋白质质量的高低取决于它所含的氨基酸种类及其含量[20]。黑水虻幼虫蛋白水解物及其超滤组分的氨基酸组成及含量见表2。

表2黑水虻幼虫蛋白水解物及其超滤组分的氨基酸组成/[g·(100 g蛋白质)-1]

Tab.2 Amino acid composition of black soldier fly larvae protein hydrolysates and their ultrafiltration fractions/[g·(100 g protein)-1]

由表2可知，黑水虻幼虫蛋白水解物及其超滤组分的氨基酸含量有一定的差异，其中，天门冬氨酸和谷氨酸的含量最高，这与Huang等[21]的研究结论一致。蛋白质营养价值的高低与EAA的种类、数量和比例有关，本研究中，<3 kDa组分的EAA/TAA值最高，为42.52%(FAO/WHO标准为40%)，说明黑水虻幼虫蛋白水解物经过超滤可以提高EAA/TAA值，从而提高其营养价值。

2.4 黑水虻幼虫蛋白水解物及其超滤组分的营养价值评价

2.4.1 EAAI法评价

根据FAO/WHO标准[19]，EAAI越高，蛋白质氨基酸组成越合理，蛋白品质越高。根据EAAI法实用评价标准：EAAI>0.95为优质蛋白，黑水虻幼虫蛋白水解物和3种超滤组分的EAAI均高于1(表2)，均属于优质蛋白。其中，<3 kDa组分的EAAI和EAA/NEAA值均最高，分别为1.32和73.97%。表明，水解和超滤工艺可以进一步提高黑水虻幼虫蛋白的营养价值。

2.4.2 RAA和RC法评价

由EAA含量及比例计算RAA和RC，对黑水虻幼虫蛋白水解物及其超滤组分的营养价值进行评价，结果见表3。

表3黑水虻幼虫蛋白水解物及其超滤组分中各种必需氨基酸的RAA和RC比较

Fig.3Comparison of RAA and RC of EAA in different fractions of black soldier fly larvae protein hydrolysates and their

注：*为第一限制性氨基酸。

由表3可知，黑水虻幼虫蛋白水解物中含硫氨基酸的RC最小，为第一限制性氨基酸；<3 kDa、3～10 kDa、>10 kDa等3种超滤组分的限制性氨基酸分别为苏氨酸、含硫氨基酸、亮氨酸；RC超过1的有异亮氨酸、芳香族氨基酸。因此，可以选择含硫氨基酸Met+Cys含量较高的食品作为补充，以提高黑水虻幼虫蛋白食品的品质。

3 结论

碱提酸沉法和醇洗法可逐级提高黑水虻幼虫脱脂虫粉的蛋白纯度；黑水虻幼虫蛋白水解物及其超滤组分的氨基酸种类齐全，且都属于优质蛋白，其中<3 kDa组分的EAA/TAA值、EAA/NEAA值和EAAI均最高，分别为42.52%、73.97%和1.32，其第一限制性氨基酸为苏氨酸。黑水虻幼虫是一种容易获得的优质蛋白资源，其水解物的第一限制性氨基酸为含硫氨基酸Met+Cys，可与高含量的含硫氨基酸食品配合使用，更好发挥其营养作用。