欧盟农药内分泌干扰物评价策略简介

2020-05-09申继忠

世界农药 2020年4期

申继忠

(1.上海艾农国际贸易有限公司，上海 220122；2.江苏耘农化工有限公司，江苏镇江 212132)

就全球范围而言，欧美最早展开内分泌干扰物相关工作。中国也于2015年颁布了《农药内分泌干扰作用评价方法》农业行业标准。

美国环保局 1996年开始着手内分泌干扰物筛选工作。内分泌干扰物筛选项目(EDSP)使用两级办法筛选农药、化合物和环境污染物对雌激素、雄激素和甲状腺激素系统的潜在影响。EPA发布了包含在EDSP中的52个化合物的筛选结果。第一阶段筛选本来包括67个物质。但是，后来有15种被登记持有人撤销或终止，不再使用，因此不再被筛选。在这52个化合物中，有20个化合物被证明对内分泌途径有潜在影响；有14个化合物显示出对一种或多种内分泌途径有潜在影响，EPA已经有足够资料得出结论，它们不构成风险(即通过第一阶段评审)。剩余的 18个化合物都表现出对甲状腺途径有潜在影响，其中 17个化合物对雄激素通路有影响，14个化合物对雌激素通路有潜在影响(18个化合物需进行第二阶段评审)。

欧盟自 1999年就开始内分泌干扰物战略(Strategy on Endocrine Disruptors)。后来欧盟的化学品立法都将这一战略考虑在内。2013年被欧洲议会和欧盟委员会采纳的第 7版环境行动项目(The 7th Environment Action Programme，简称EAP)规定了统一的有危害的内分泌干扰物鉴定标准。欧盟农药新法规[Regulation (EC) 1107/2009]和杀生物剂法规[Biocidal Products Regulation (EU) 528/2012]要求建立内分泌干扰物鉴定标准。因此，杀生物剂内分泌干扰物鉴定标准[Commission Delegated Regulation(EU) 2017/2100]于2017年9月4日发布，从2018年6月 7日开始实施。农药内分泌干扰物鉴定标准[Commission Regulation (EU) No 2018/605]则于2018年4月19日发布，从2018年11月10开始实施。

2018年6月欧盟颁布了在杀生物剂法规和农药法规背景下的内分泌干扰物鉴定指导[Guidance for the identification of endocrine disruptors in the context of Regulations (EU) No 528/2012 and (EC) No 1107/2009]。该指导的第3部分是其核心内容：即评价某种物质是否满足内分泌干扰物标准的策略(Strategy to assess whether a substance meets the endocrine disruptor criteria)。

该指导的目的是为执行杀生物剂和植物保护剂法规中规定的 ED标准提供技术指导。该指导服务对象是登记申请人和农药主管当局评审员。

该指导的内容包括⑴ 内分泌干扰物定义，即与ED标准一样，采用WHO/IPCS(国际化学品安全规划署)的内分泌干扰物定义：“内分泌干扰物是一种外源物质或混合物，能改变内分泌系统的功能，从而对一个完整的生物体或其后代或(亚)群体造成不利的健康影响”。⑵ 该指导覆盖雌性激素(estrogen)、雄性激素(androgen)、甲状腺(thyroid)和类固醇的合成方式(steroidogenesis)，这4项统称EATS模式的内分泌干扰作用机制。但是，对于可获得的具有非EATS(Non-EATS modalities)作用机制的内分泌干扰作用的信息也要予以考虑。⑶ 该指导覆盖对脊椎动物，即哺乳动物(包括人类)、鱼类和两栖动物的内分泌干扰作用，即对人和非靶生物的影响。

本文重点介绍该指导提出的内分泌干扰物标准和评价策略。

1 内分泌干扰物标准

欧盟杀生物剂法规[Regulations (EU) No 528/2012]和农药法规[Regulations (EC) No 1107/2009]分别要求对杀生物剂(biocides)和农药进行内分泌干扰特性评价。之后又分别发布了确定杀生物剂和农药之内分泌干扰特性的科学标准[Commission Delegated Regulation (EU) 2017/2100和Commission Regulation (EU) 2018/605]。

确定内分泌干扰性质的标准有两套，一是对人，二是对非靶标生物。这两套标准都被进一步分为两部分：第一部分是对 ED进行定义，第二部分是确定ED性质需要考虑的信息。

第一部分是定义在什么情况下某种物质可以被认为具有干扰内分泌性质。这部分对人和非靶标生物都是一样的。

根据 ED标准，如果某种物质同时符合下列 3项标准，则该物质应被视为具有内分泌干扰性质。3项标准为：⑴ 该物质对某种完整的有机体(或其后代)或非靶标生物显示出某种或多种不利影响。这种不利影响包括形态、生理、生长、发育、繁殖变化或生物体寿命、系统或(子)群变化。这些变化能导致功能性能力的损伤，这种能力的损伤可弥补额外的压力或对其他因素的敏感性的增加；⑵ 该物质具有内分泌活性，即它能改变内分泌系统的功能；⑶ 上述不利影响与评价出来的内分泌活性之间有生物学合理性联系。

需要分别针对人类和非靶标生物而得出是否满足 ED标准的结论。内分泌干扰作用的识别策略需从回答以下两个问题开始：⑴ 内分泌活性与所观察到的与人类有关的有害影响之间是否存在生物学上可信的联系；⑵ 内分泌活性与所观察到的在种群水平上的对非靶标生物体的不良影响之间是否存在生物学上可信的联系。

上述两个问题都必须得到解答，并且根据法规(EC) No 1107/2009和法规(EU) No 528/2012的要求，对人类和非靶标生物的内分泌干扰作用都必须得出结论。

为评价对人和非靶标生物的内分泌干扰作用所需要的信息有很多重叠。哺乳动物数据总与非靶标生物的 ED评价有关。更有甚者，从非靶标生物得到的信息也可能与人的ED评价有关。

第二部分规定了确定(包括对人和非靶生物)ED性质时需要的信息。根据ED标准，“所有可得到的相关数据”都必须考虑在内，ED标准规定采用证据权重方法对科学数据予以评价。

评价内分泌干扰特性的标准规定：在应用证据加权时，对科学证据的质量、可靠性、重现性和一致性的评估要特别考虑表1中的所有因素。针对人类或针对非靶标生物体的内分泌干扰特性的评估需要考虑的因素不同(表1)。

表1 ED标准中列出的在证据加权评价中必须考虑的因素

2 内分泌干扰物评价策略

2.1 确定评价策略的总原则

评价策略的制定是为了有效地利用可获得的数据，总的原则是对ED 的评价始于对现有数据的利用。前提是数据必须符合杀生物剂(农药)法规要求。其次，只有在必要时才能产生进一步的数据。第三是对哺乳动物/人以及非靶标生物的作用的可获得的信息要在评价中全面使用。

2.2 确定凭借策略的法规和技术依据

⑴ 杀生物剂和植物保护剂的内分泌干扰物标准(Commission Delegated Regulation (EU) 2017/2100和Commission Regulation (EU) 2018/605)。

⑵ 关于内分泌干扰物测试和评价的 OECD概念框架(OECD CF)：在其中列出可用于评价物质之内分泌干扰作用的OECD测试指导和其他标准的测试方法。提供测试方法使用指导，但不是测试策略。

⑶ 关于内分泌干扰物评价标准化试验指导的OECD指导文件150(OECD GD 150)。它有助于解释ED测试中获得的结果(参数)。

2.3 五步评价策略

2.3.1 总策略

⑴ 为了研究内分泌活性，应采用分步进行的方法，使用表2列出的测试数据，并考虑到现有的信息，遵循图1所述的策略。

⑵ 该策略建议进行表2列出的第2级测试即离体测试(或使用来自文献的等效信息)，以减少动物测试，以促进MoA分析。

⑶ 按照图 1的策略，当离体测试结果为阳性时，就足以进行作用机制(MoA)分析。

⑷ 然而，如果离体试验为阴性，由于内分泌系统的复杂性和目前离体试验的局限性，这通常也不足以证明被试物质没有活体测试内分泌活性(因此需要进一步的活体试验)。

表2 推荐的调查EATS-有关的内分泌活性的试验方法

2.3.2 评价策略之第一步：搜集所有相关信息

所有相关信息包括但不限于：⑴ 依据标准指导进行研究获得的数据；⑵ 其他科学数据，包括非标准试验数据、QSAR模型和交叉参照(read-across approaches)获得数据、离体方法获得数据、数据库数据、流行病数据、田间、监测和种群模拟数据等。

其次要根据农药和杀生物剂等法规之规定对数据质量进行评价。把有效研究数据(参数)根据其与ED评价的相关性归为如下各组：⑴ 活体方式(in vivo mechanistic)；⑵ 离体方式(in vitro mechanistic)；⑶ EATS-介导的方式(EATS-mediated)；⑷ 对 EATS敏感，但不作为对EATS的诊断。

2.3.3 评价策略之第二步：收集、评价和整合证据链

在搜集所有可获得的信息后，分组整合证据链:

⑴ 收集和评价来自如下方面的有害影响证据链：① “EATS-介导”的参数；② “对 EATS敏感”，但不作为对EATS的诊断的参数。

⑵ 收集和评价来自如下方面的内分泌活性证据链：① “离体试验”参数；②“活体试验”参数；③“EATS-介导的”参数(活体参数)；④ 整合有害影响和内分泌活性两方面证据链；⑤ 报告数据链。

2.3.4 评价策略之第三步：证据的初步分析

通过对证据的分析，可以得出3种结论：

⑴ 在下面情况下，可以得出“不符合ED标准”的结论：① “EATS-介导”的参数得到充分研究但是没有观察到EATS介导的有害影响；或者 ②内分泌活性得到充分研究但是没有观察到内分泌活性(而且没有EATS介导的有害影响)。

⑵ 在下面情况下转向作用机制(MoA)分析：①观察到EATS介导的有害影响；或② 观察到内分泌活性。

⑶ 在下面情况下，需要生成新的信息(数据)：没有发现 EATS介导的有害影响而且没有观察到内分泌活性，但是内分泌活性没有得到充分研究。

2.3.5 评价策略之第四步：作用机制(MoA)分析

当潜在的与内分泌有关的有害影响和内分泌活性被确定后，则两者之间的生物学合理性联系必须得到确立(利用现代科学知识和证据权重方法)。这种“生物学合理性联系”就是作用机制。内分泌干扰物的作用机制(MoA)是指能导致特定有害影响的一系列生物学事件(KE)，这些事件产生有害影响。至少这些生物学事件之一牵涉到内分泌干扰系统的一个或多个要素。

MoA分析步骤：

⑴ 首先假定有害影响和/或内分泌活性作用机制(MoA)，如表3。

⑵ 建立生物学合理性联系，可能是如下一种或几种：① EATS-介导的有害影响；② 对EATS参数敏感但不能作为诊断依据的有害影响；③ 基于非-EATS内分泌参数的有害影响；④ 多作用机制；⑤替代性非-内分泌作用机制。

⑶ 考虑哪些进一步的信息有助于阐明假定的作用机制。

⑷ 另外还要考虑非-内分泌或非-EATS介导的作用机制。

⑸ 所获得证据对作用机制分析全面评价的支持程度。

⑹ 得出MoA分析的结论。

2.3.6 评价策略之第五步：所评价物质是否符合ED标准的结论

⑴ 根据足够的数据集，没有观察到“EATS-介导”的有害作用，或者内分泌活性呈阴性，则可以忽略(by-passed)作用机制(MoA)分析，从而得出不符合ED标准的结论。

⑵ 如果某种作用机制(MoA)是基于“EATS-介导”的有害影响，那么就被认为符合ED标准，除非证明替代性非-内分泌作用机制是更好的解释。

⑶ 如果某种作用机制是建立在“对EATS敏感性而非诊断性”有害作用的基础上，并且大量证据支持有害作用和内分泌活性之间的生物学合理性联系，那么就认为符合ED标准，除非证明替代性非-内分泌作用机制是更好的解释。

2.3.7 草甘膦案例

2016年，欧盟委员会要求欧洲食品安全局考虑该农药潜在的内分泌活性信息。评估报告说：“目前的评估得出的结论是，大量证据表明，草甘膦不会通过雌激素、雄激素、甲状腺或类固醇生成的方式干扰内分泌。该研究基于毒理学领域的全面数据库。”食品安全机构2017年9月7日发布的评估报告发现，没有证据表明草甘膦对人体激素系统有有害影响。欧洲食品安全局(EFSA)得出结论，世界上使用最多的农药草甘膦不具有内分泌干扰特性。这一结果也与美国环境保护署在2015年6月得出的结论一致。

图1 在内分泌干扰物评估背景下调查EATS-有关的内分泌活性的试验策略

表3 假定的作用机制(MoA)举例

但是，一项新的研究表明，草甘膦制剂(农达)是一种成年雄性大鼠内分泌干扰物。测试发现最低剂量10 mg/kg bw/d的草甘膦可降低大鼠皮质脂酮水平，皮质脂酮是肾上腺产生的类固醇激素。因为没有发现草甘膦在这种剂量下有其他毒性作用，所以如果没有专门研究草甘膦对内分泌的影响，就不会有其他迹象表明这种剂量的草甘膦有毒。研究人员并没有针对更低剂量水平的农达进行测试，因此不知道在内分泌紊乱方面是否存在“安全”的低剂量农达。在技术上，这意味着没有发现 NOAEL(没有观察到的不良影响水平)。

3 评价内分泌干扰物所需信息来源

根据上述内分泌干扰物评价策略可知，收集各种信息，包括试验数据、文献数据以及各种非试验数据等。表4归纳了该指南给出的评价内分泌干扰物需要收集的信息来源。

表4 支持内分泌干扰物评价的信息来源

此外，OECD GD150提供了各种分级测试方法指导，共分为5级。很多数据都是由这些试验产生。为便于参考，特将这些方法指导列出(表4-8)。

表5-9所列是OECD测试指导和现有的标准测试方法。所列方法不完全是目前内分泌干扰物评价策略所要求的，只是提供现有的测试方法名单以及它们所能提供的信息。由于内分泌干扰领域仍在发展中，因此，这些方法也要经历不断变化。目前美国环保局内分泌干扰物筛选项目(EDSP)采取的两级筛选体系所用的方法中的某些方法未来可能由替代方法所取代(表10)。

表5 第一级测试方法(现有数据好而非测试信息)

4 结语

欧盟内分泌干扰物鉴定指导为申请者和主管机构的评价者提供进行 ED评价或评估的指导。该评价策略的建立是为了有效地利用可用的数据。针对杀生物剂登记所要求的核心数据集可能足以进行ED评价，只有当必要时才进行更多数据的生产。对EATS-介导的有害影响的知识可能足以进行作用机制(MoA)分析并对内分泌活性与有害作用之间的生理上的合理性联系做出结论。