Meprinα 对TGF-β1诱导的成纤维细胞胶原合成的调节作用

2020-05-09张诗汇靳馥宇

昆明医科大学学报 2020年4期

王珺，张乙，张诗汇，靳馥宇，李田，徐洪

（华北理工大学基础医学院/河北省器官纤维化重点实验室，河北唐山 063210）

课题组前期研究发现，N-乙酰-丝氨酰-天门冬氨酰-赖氨酰 -脯氨酸（n-acetyl-serylaspartyl-lysyl-proline，Ac-SDKP）能够显著拮抗矽肺大鼠肺纤维化，在体外能够抑制转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β1介导胶原合成和肌成纤维细胞分化[1-2]。Ac-SDKP来源于胸腺素β4，其中内肽酶meprinα 是胸腺素β4水解成为Ac-SDKP的关键酶之一[3-4]。Meprin属于金属蛋白酶超家族，含有α 和β两个亚基，能够水解基质膜蛋白、细胞因子、紧密连接蛋白、生长因子、蛋白激酶等多种成分，一些研究认为Meprin在器官纤维化中发挥了重要的调节作用[5-6]。因此本研究拟通过体外原代培养肺成纤维细胞，并予以TGF-β1诱导向肌成纤维细胞分化，观察重组Meprinα 对肺成纤维细胞胶原合成和肌成纤维细胞转化的调节作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

达尔伯克（氏）改良伊格尔（氏）培养基（dulbecco modified eagle medium，DMEM）（10099141，美国GIBCO公司）；胎牛血清（BI-SH0019，以色列BI公司）；GAPDH兔多克隆抗体（sc-25778，美国Santa Cruz公司）；I型胶原（ab34710，英国Abcam公司）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA，ab32575）、M eprin α（ab232892）；重组 TGF-β1蛋白（240-B，美国R&D公司）、重组Meprin α 蛋白（4007-ZN，美国R&D公司）、放线酰胺素（Actinonin，c3331，美国APExBIO公司）。

1.2 细胞培养及分组

采用贴壁法培养肺成纤维细胞，取新生1～3 d乳鼠，取肺组织剪成小块儿，采用血清平铺于培养瓶底，翻转放置6 h。待细胞爬出呈次融合状态时，传代，取3～4代细胞进行实验。同步化24 h后，细胞分组为：（1）对照组：无血清培养；（2）TGF-β1诱导组：无血清培养条件下，予以5 ng/mL TGF-β1诱导；（3）Meprin α 预处理组：无血清培养条件下，先予以100μmol/L Meprin α预处理1 h，再给予5 ng/mL TGF-β1共诱导；（4）Actinonin预处理组：无血清培养条件下，先予以20μmol/L actinonin预处理1 h，再给予5 ng/mL TGF-β1共诱导。

1.3 CCK-8法检测细胞增殖

按照5×103/ 孔将细胞种植于96孔板，同步化后按照实验设计分组并诱导，24 h后每孔加入10μL CCK溶液，细胞培养箱中孵育1 h，酶标仪于450 nm测定吸光度。

1.4 划痕实验

以2×105/孔的密度将细胞种植于24孔板，同步化后使用200μL枪头划痕，按照实验设计分组并诱导，分别于0 h、48 h倒置显微镜下拍照，采用IPP 6.0图像分析软件测定划痕区域面积，迁移率计算公式

1.5 免疫细胞荧光染色

细胞常规爬片，高压修复，血清封闭1 h，滴加α-SMA一抗（1:200）4℃过夜，次日二抗37℃孵育1 h，含DAPI封片剂封片，荧光显微镜下观察扫图。

1.6 免疫印迹

每25 cm2培养瓶加入100μL细胞裂解液，冰上静置15 min，刮取细胞移至EP管，12 000 g离心15 min取上清。Brafford法测定蛋白浓度，10μg/ 泳道上样，常规电泳和电转。孵育Meprin α、α-SMA、I型胶原一抗（1:1 000）4 ℃过夜，二抗（1:5 000）37℃1h后，ECL发光显色，采用Image-Lab 5.1软件定量分析条带，目的条带的OD值经相应内参平衡后与对照组的比值作为该蛋白的相应表达量。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 重组Merpin α 能够抑制TGF-β1介导的肺成纤维细胞的增殖

与对照组相比较，TGF-β1诱导组的OD值增加；与TGF-β1诱导组相比较，Merpin α 预处理组的OD值减小，经方差分析差异均具有统计学意义（P＜0.05）；而Actinonin预处理组OD值与TGF-β1诱导组差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2 重组Merpin α 能够抑制TGF-β1介导的肺成纤维细胞的迁移

与对照组的相比较，TGF-β1诱导组的迁移率增高；与TGF-β1诱导组相比较，Merpin α 预处理组的迁移率降低，Actinonin预处理组迁移率升高，经方差分析差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

2.3 重组Merpin α 能够抑制TGF-β1介导的肺成纤维细胞的I型胶原和α-SMA的表达

见图2、图3、表2所示，与对照组比较，TGF-β1诱导组I型胶原、α-SMA表达水平显著上调，Merpin α 表达水平显著下调，免疫荧光染色显示α-SMA阳性表达，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4、表3。与TGF-β1诱导组相比较，Merpin α 预处理组的I型胶原、α-SMA表达水平显著下调；如图4、表4所示，与TGF-β1诱导组相比较，Actinonin预处理组I型胶原、α-SMA表达水平显著上调，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 重组Meprin α 和Actinonin对TGF-β1诱导的成纤维细胞增殖和迁移的影响（）Tab.1 The effects of meprin α and actinonin on cell proliferation and cell migration in lung fibroblasts induced by TGF-β1（）

与对照组比较，*P ＜0.05；与TGF-β1诱导组比较，#P ＜0.05。

表2 TGF-β1对Meprin α 表达的调节作用（）Tab.2 The effect of TGF-β1 on the expression of meprin α（）

表3 重组Merpin α 对TGF-β1介导的COL I和α-SMA的调节作用（）Tab.3 The regulation of recombinant meprin α on the ex pression of COL I and α-SMA induced by TGF-β1（）

表4 Actinonin对TGF-β1介导的COL I和α-SMA的调节作用（）Tab.4 The regulation of actinonin on the expression of COL I and α-SMA induced by TGF-β1（）

3 讨论

图1 重组Merpin α 抑制TGF-β1介导的肺成纤维细胞的迁移Fig.1 Merpin α inhibits fibroblasts migration induced by TGF-β1

图2 重组Merpin α 对TGF-β1介导的α-SMA表达的调节作用Fig.2 The effect of merpin α on the expression of α-SMA in lung fibroblast induced by TGF-β1

图3 TGF-β1对Merpin α 表达的调节作用Fig.3 The effect of TGF-β1on the expression of merpin α in lung fibroblast induced by TGFβ1

图4 重组Merpin α 和Actinonin对TGF-β1介导的COL I和α-SMA的调节作用Fig.4 The effect of merpin α and actinonin on the expression of COL I and α-SMA in lung fibroblasts induced by TGF-β1

Meprins属于金属蛋白酶家族，包含两个α、β亚基，可以各自或与对方聚合形成寡聚蛋白，其中包含α 亚基的称为Meprin A蛋白，多定位于膜上或形成可溶性Meprin α 蛋白而分泌到细胞外基质[5-6]。研究表明，Meprin α 在肾小管上皮细胞中强表达，能够水解胸腺素β4形成Ac-SDKP，是体内Ac-SDKP合成的主要来源之一[3-5]。课题组多年围绕Ac-SDKP的抗矽肺纤维化作用进行了系列研究，发现Ac-SDKP及其相关血管紧张素系统关键调节肽能够抑制肌成纤维细胞分化，包括肺泡II型上皮细胞，抑制细胞外基质沉积从而发挥拮抗矽肺大鼠肺纤维化的作用[1，2，7-9]，因此推测，Meprin α 可能在体内具有调节胶原代谢的作用。

研究表明，Meprinα、β亚基能够水解I型胶原前肽，诱导原纤维组装，促进胶原成熟；Mep1a-/-和Meplb-/-基因敲除小鼠较野生型小鼠相比较，皮肤胶原纤维排列不规则，厚度降低，提示Merpins能够调节皮肤胶原代谢[10]。与野生型小鼠相比较，Mep1a-/-、Meplb-/-和双基因敲除小鼠博来霉素染毒后肺功能、炎症指标差异并不显著，但Meplb-/-基因敲除小鼠较野生型小鼠其胶原沉积水平降低，提示Meprinβ可能与肺纤维化的形成关系较为紧密[11]。在针对肺动脉高压的研究中也发现，Meprin α 能够抑制炎症细胞及炎症介质对血管内皮细胞的损伤作用[12]。而在肿瘤微环境的研究中，关于Meprin α 的作用机制尚不明确，甚至有争论。这些研究多认为，Meprin α 可水解炎性介质、胶原蛋白和生长因子，可以执行激活或失活各类活性物质的作用[13-15]，但其在纤维化疾病中的具体作用机制，尚未完全了解。

在本研究中，给予重组Merpin α 预处理，能够显著抑制肺成纤维细胞的增殖、迁移，并抑制其向肌成纤维细胞分化和胶原沉积，提示Merpin α 具有抗纤维化作用的潜能。课题组最近的研究也显示，Merpin α 可被血管紧张素转化酶2、血管紧张素（1-7）信号所激活，从而促进Ac-SDKP的生成，减轻矽肺纤维化病变程度，抑制肌成纤维细胞分化[9]。上述结果说明，外源性给予重组merpin α 能够调节胶原代谢。由于merpin α 的器官定位、细胞定位以及形成寡聚蛋白成分不同，其作用机制可能不同，仍需进一步研究确定。