外源性趋化因子在高糖环境下对人脐静脉内皮细胞功能的影响

胡海林，罗 敏

目的：探讨高糖环境下外源性趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)功能的影响及其机制。

方法：将对数生长期的细胞分为对照组(葡萄糖浓度5.5mmol/L)、低糖组(葡萄糖浓度5mmol/L)、高糖组(葡萄糖浓度30mmol/L)，分别加入CXCL9(100ng/mL)、CXCL10(10ng/mL)、CXCL11(100ng/mL)，培养24、48、72h，采用CCK-8法检测细胞增殖能力，RT-PCR检测CXCR3 mRNA的表达，免疫荧光法检测细胞增殖标志分子Ki-67阳性表达情况。

结果：CCK-8法检测结果显示，加入三种外源性趋化因子后，随着时间的延长，对照组细胞吸光度值逐渐增强；低糖组细胞吸光度值呈现先增强后降低的趋势，48h达到高峰；高糖组细胞吸光度值总体呈降低趋势。RT-PCR检测结果显示，加入三种外源性趋化因子后48、72h，低糖组和高糖组细胞CXCR3 mRNA表达水平均高于对照组，且均较同组24h时升高。免疫荧光检测结果显示，加入三种外源性趋化因子后72h，低糖组与高糖组细胞Ki-67荧光强度降低，高糖组变化更明显。

结论：高糖环境下外源性加入CXCL9、CXCL10、CXCL11可使HUVEC细胞活力下降并诱导CXCR3表达增强，且以外源性加入CXCL10、CXCL11配体后，CXCR3表达增幅最高，这可能成为临床干预糖尿病视网膜病变的靶点。

0 引言

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者眼部最常见的并发症之一，是世界范围内主要的致盲性眼病[1-2]。DR患者表现为视力模糊，眼前有暗点或闪烁的灯光以及视力丧失，眼底检查表现为微血管瘤、出血、渗出、视网膜内微血管异常、静脉串珠样改变、新生血管等。糖尿病患者由于高血糖引起血管内皮细胞凋亡，氧化酶损伤，微血栓形成，细胞黏附分子活化，白细胞淤积和细胞因子活化，继之缺氧调节的生长因子表达增加和细胞因子产生导致微循环障碍。DR的发病机制包括异常代谢途径、氧化应激和慢性炎症等学说[3-4]。近年来，慢性炎症学说越来越受到国内外学者的关注。靶向抗炎治疗，如抗血管内皮生长因子(VEGF)或皮质类固醇类药物玻璃体腔注射等，可以在一定程度上延缓DR的发展[4-5]。

白细胞在视网膜微血管的黏附可能是激活DR复杂病理过程的起始途径，趋化因子参与了这一过程。趋化因子是细胞因子超家族中的一种由70～80个氨基酸组成，对白细胞等细胞具有趋化作用的小分子蛋白质[6]。γ-干扰素诱导的单核因子(CXCL9)、干扰素诱导蛋白10(CXCL10)、干扰素诱导的T细胞α化学引诱剂(CXCL11)是趋化因子CXCR3的3个配体[7-8]。CXCR3是表达在T细胞表面的趋化因子受体，能诱导趋化、细胞迁徙和黏附。临床研究表明，CXCR3在临床监测DR病情严重程度上具有一定价值[9]。动物研究也表明，CXCR3族趋化因子参与了DR的病程变化[10]。然而，CXCR3的3个配体在DR发展过程中所起的作用不明。因此，本研究从细胞学角度研究CXCR3的3个配体与DR病情之间的关联，以便为寻找治疗DR的靶点提供依据。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1细胞和试剂 人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)(上海细胞生物研究所)；DMEM(Gibco，美国)，抗生素(青-链霉素)、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(Hyclone，美国)，CXCL9、CXCL10、CXCL11(Bioleng，美国)，CXCR3抗体(Abcam，美国)，CCK-8细胞活性检测试剂盒(同仁公司，日本)，鼠抗Ki67单克隆抗体、Alexa Fluor 488羊抗鼠二抗、SYBR green one Real-time PCR试剂盒(TaKaRa，日本)，Trizol试剂盒(Life technology，美国)。

1.1.2主要仪器 恒温CO2培养箱(Thermal，美国)，倒置显微镜(OLYMPUS，日本)，程序降温冻存盒(Nalgene，美国)，-80℃低温冰箱(SANYO，日本)，JB90-1定时磁力搅拌器(上海衡平仪器厂)，PHS-2C型酸度计(上海伟业仪器厂)，旋涡混合器MAXIMIX plus TM (Thermolyne，美国)，台式低温离心机(Beckman Coulter，法国)，电热恒温水温箱(上海医疗器械五厂)，高速离心机(Beckman Coulter，美国)，精密天平BS110S(Sartorius，德国)，电泳仪及电转仪Mini Protein Ⅱ型(Bio-Rad，美国)，制冰机F-120C-50型(HOSHIZAKI，日本)，Envsion全波段酶标检测仪(PE，美国)，电泳系统(电泳仪、电泳槽等)，Bio-Rad GelDoc 2000成像系统，Stratagene Mxp3000荧光PCR仪。

1.2方法

1.2.1细胞培养与分组 HUVEC置于含10%胎牛血清的培养液中，37℃、5% CO2恒温孵育箱内培养，1～2d更换培养液，细胞融合率达到90%～95%后按1∶3以上的比例进行传代培养，约2～3d消化传代一次。将对数生长期的细胞分为对照组(葡萄糖浓度5.5mmol/L的培养基培养)、低糖组(葡萄糖浓度5mmol/L的培养基培养)、高糖组(葡萄糖浓度30mmol/L的培养基培养)进行实验。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖能力 根据实验分组将HUVEC细胞接种至96孔板，每孔5000个细胞(200μL相应的培养基)，分别加入趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11，终浓度分别为100、10、100ng/mL。培养24、48、72h，向待测孔中加入20μL CCK-8试剂孵育2h后，在酶标检测仪450nm下检测吸光度值(OD)。检测3次，取平均值。

1.2.3 Real-time PCR检测CXCR3 mRNA的表达 根据实验分组将HUVEC细胞接种至6孔板中，每孔2×104个细胞，分别加入趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11，终浓度分别为100、10、100ng/mL。培养24、48、72h。利用Trizol法抽提细胞总RNA，进行浓度检测后，使用反转录试剂盒合成cDNA。采用SYBR green 法对CXCR3进行Real-time PCR检测，管家基因GAPDH作为内参，以2-△△Ct值计算CXCR3 mRNA的相对表达量。CXCR3正向引物5’-CCACCTAGCTGTAGCAGACAC-3’，反向引物5’-AGGGCTCCTGCGTAGAAGTT-3’。GAPDH正向引物5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反向引物5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

1.2.4免疫荧光法检测细胞增殖标志分子Ki67含量 将HUVEC细胞接种至放置爬片的6孔板中，每孔2×104个细胞，孵育24h，换不同葡萄糖浓度的培养基并分别加入趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11，终浓度分别为100、10、100ng/mL。72h后，去除培养基，PBS漂洗3次。用4%多聚甲醛固定10min，PBS漂洗3次，10%驴血清封闭30min；加入鼠抗Ki67单克隆抗体(1∶1000)，4℃孵育过夜；次日用PBS漂洗3次，加入Alexa Fluor 488羊抗鼠二抗室温避光孵育2h，随后漂洗3次，10min/次，加入DAPI染色20min，PBS冲掉染色液后用滤纸吸干，封片后在荧光显微镜下进行观察。以细胞核出现绿色荧光为Ki67阳性染色，计数每视野荧光细胞数和总细胞数，并计算荧光细胞百分比。

2 结果

2.1外源性趋化因子对HUVEC细胞增殖的影响 CCK-8法检测结果显示，加入外源性趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11后，随着时间的延长，对照组细胞吸光度值逐渐增强；低糖组细胞吸光度值呈现先增强后降低的趋势，48h达到高峰；高糖组细胞吸光度值总体呈降低趋势(表1)。加入三种趋化因子后24h，三组细胞吸光度值差异均无统计学意义(P>0.05)；加入三种趋化因子后48h，高糖组与对照组细胞吸光度值差异有统计学意义(P<0.05)，且加入CXCL11时低糖组与对照组细胞吸光度值差异有统计学意义(P<0.05)；加入三种趋化因子后72h后，低糖组和高糖组细胞吸光度值分别与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，且加入CXCL10时低糖组与高糖组细胞吸光度值差异有统计学意义(P<0.05)。

趋化因子组别培养24h培养48h培养72hCXCL9对照组0.42±0.050.88±0.161.09±0.17低糖组0.40±0.100.60±0.120.55±0.12高糖组0.45±0.060.38±0.070.26±0.09P(对照组 vs 低糖组)0.7720.1930.008P(对照组 vs 高糖组)0.5420.0230.001P(低糖组 vs 高糖组)0.4990.4300.115CXCL10对照组0.38±0.100.89±0.181.07±0.16低糖组0.41±0.080.61±0.140.57±0.11高糖组0.42±0.110.35±0.130.23±0.08P(对照组 vs 低糖组)0.7060.1890.007P(对照组 vs 高糖组)0.6650.014<0.001P(低糖组 vs 高糖组)0.9050.2450.042CXCL11对照组0.50±0.130.96±0.091.11±0.13低糖组0.44±0.060.56±0.110.55±0.11高糖组0.41±0.100.43±0.160.25±0.08P(对照组 vs 低糖组)0.5080.0220.003P(对照组 vs 高糖组)0.3960.006<0.001P(低糖组 vs 高糖组)0.6790.7660.056

注：CXCL9：F时间=11.14，P时间=0.002；F组间=15.18，P组间=0.004；F组间×时间=12.51，P组间×时间<0.001。CXCL10：F时间=11.46，P时间=0.002；F组间=19.38，P组间=0.002；F组间×时间=12.35，P组间×时间<0.001。CXCL11：F时间=13.13，P时间=0.001；F组间=29.95，P组间=0.001；F组间×时间=13.61，P组间×时间<0.001。

趋化因子组别培养24h培养48h培养72hCXCL9对照组1.01±0.201.07±0.191.04±0.18低糖组3.20±1.204.20±0.804.37±0.51高糖组4.46±0.955.40±0.675.30±0.51P(对照组 vs 低糖组)0.0710.002<0.001P(对照组 vs 高糖组)0.009<0.001<0.001P(低糖组 vs 高糖组)0.3980.1570.019CXCL10对照组1.05±0.211.00±0.201.01±0.19低糖组3.20±1.084.60±0.804.33±0.51高糖组4.80±1.306.10±0.406.00±1.11P(对照组 vs 低糖组)0.1080.0100.004P(对照组 vs 高糖组)0.0100.002<0.001P(低糖组 vs 高糖组)0.2800.2910.036CXCL11对照组0.98±0.210.98±0.181.02±0.23低糖组3.14±1.153.73±1.124.06±0.39高糖组4.33±0.765.67±0.725.50±0.49P(对照组 vs 低糖组)0.0510.015<0.001P(对照组 vs 高糖组)0.0070.001<0.001P(低糖组 vs 高糖组)0.3640.0660.003

注：CXCL9：F时间=19.41，P时间<0.001；F组间=35.42，P组间<0.001；F组间×时间=4.48，P组间×时间=0.019。CXCL10：F时间=45.12，P时间<0.001；F组间=23.22，P组间=0.001；F组间×时间=13.74，P组间×时间<0.001。CXCL11：F时间=12.26，P时间=0.001；F组间=38.8，P组间<0.001；F组间×时间=3.71，P组间×时间=0.034。

2.2外源性趋化因子对HUVEC细胞CXCR3 mRNA表达的影响 RT-PCR检测结果显示，外源性趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11加入48、72h后，低糖组和高糖组细胞CXCR3 mRNA表达水平高于24h(表2)。加入外源性趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11后 24h，高糖组细胞CXCR3 mRNA表达水平比对照组高，差异均有统计学意义(P<0.05)；加入三种趋化因子后48h，低糖组、高糖组细胞CXCR3 mRNA表达水平与对照组差异均有统计学意义(P<0.05)；加入三种趋化因子后72h后，低糖组、高糖组细胞CXCR3 mRNA表达水平与对照组，低糖组和高糖组差异均有统计学意义(P<0.05)。

图1 加入外源性趋化因子后72h Ki-67免疫荧光显色图(×40) A：加入CXCL9；B：加入CXCL10；C：加入CXCL11。

组别CXCL9CXCL10CXCL11对照组37.0±5.244.2±4.140.7±4.6低糖组20.7±4.516.7±4.324.5±3.5高糖组16.8±2.516.2±2.615.2±4.9 P(对照组 vs 低糖组)0.0150.0010.008P(对照组 vs 高糖组)0.0040.0010.003P(低糖组 vs 高糖组)0.2600.8720.056

注：FCXCL9=19.302，PCXCL9=0.002；FCXCL10=54.939，PCXCL10<0.001；FCXCL11=26.102，PCXCL11=0.001。

2.3外源性趋化因子对HUVEC细胞增殖标志分子Ki67表达的影响 免疫荧光检测结果显示，加入外源性趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11后72h，与对照组相比，低糖组与高糖组细胞Ki-67荧光强度降低，阳性细胞数明显减少，差异均有统计学意义(P<0.05)，且高糖组降低更明显(图1，表3)。

3 讨论

随着糖尿病患病人数的增多，DR的发病率也越来越高[11]。有研究人员在2017年对我国山东等省糖尿病患者进行调查发现，DR发病率高达34.08%[12]。随着DR病情的进展，可造成不可逆的视力损害，对视觉健康造成巨大的影响，因此找到DR的治疗靶点至关重要[13]。研究表明，DR是一种高血糖引起的视网膜慢性低度炎症性疾病[14]。动物和临床实验均证实，CXCR3参与这一炎症反应过程，但其配体CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCR3结合后在DR发展过程中所起的作用不明，本研究从细胞学角度研究CXCR3的3个配体与DR病情之间的关联，从而为发现DR治疗的靶点提供一定的依据。

有研究认为，CXCL9通过与相应受体相互作用，活化各类白细胞并趋化至病灶处，调节免疫细胞的迁移，在炎症性疾病的发病过程中起着关键性作用[15]。CXCL10对于T细胞的发育、迁移、黏附起着重要作用，还能够活化单核细胞及自然杀伤细胞，参与多种自身免疫疾病的发生发展过程[16]。 CXCL11和受体结合后，可以诱导T细胞迁移，产生促炎作用，抑制血管内皮生长，调控血管生成等[17]。

本研究中，CCK-8法检测结果显示，在加入三种外源性趋化因子后，随着时间的延长，对照组细胞吸光度值逐渐增强，低糖组48h达到高峰，72h又呈下降趋势，而高糖组除加入CXCL11 48h时略有增长外，总体呈降低趋势。该结果表明高糖环境下，加入三种外源性趋化因子后，细胞生长抑制，细胞活力下降，这与既往研究结果一致[18]。此外，RT-PCR检测结果表明，加入三种外源性趋化因子后，低糖组和高糖组细胞CXCR3 mRNA较对照组均出现增高的趋势，且在48、72h时有统计学差异，提示三种外源性趋化因子和CXCR3的作用存在一定的时间性。高糖环境下，三种外源性趋化因子与CXCR3作用引起其表达下降拐点出现在48h，分析早期高糖环境下趋化因子能招募免疫细胞(如Th1细胞)，发挥抑制血管新生作用[19]。目前，国内关于CXCL9、CXCL10及CXCL11与DR的相关报道较少，推测可能是该三种外源性趋化因子有不同的调控机制，其表达有不同的时间性和空间性，在不同的条件下有不同的优势因子，所以该三种趋化因子与DR及其临床表现的相关性并不完全一致。

综上，本研究表明，高糖环境下外源性加入CXCL9、CXCL10、CXCL11可使HUVEC细胞活力下降并诱导CXCR3表达增强，且以外源性加入CXCL10、CXCL11配体后，CXCR3表达增幅最高，这可能成为临床干预糖尿病视网膜病变的靶点。