一株降解石油烃假单胞菌的鉴定及降解特性

2020-05-08曾繁城高鹏飞

吉林化工学院学报 2020年3期

刘虹，曾繁城，高鹏飞

(1.吉林化工学院资源与环境工程学院，吉林吉林 132022；2.吉林省中实环保工程开发有限公司，吉林长春 130031)

近几年，石油在储运和加工过程中对水环境、土壤环境等造成的污染日渐严重.石油烃一旦进入环境，将在环境介质中不断地富集，从而对人类的健康及动植物的生长造成严重的影响[1-2].石油烃是由不同的碳氢化合物组成的混合物质，主要组分有饱和烃和芳烃等.其组分中，大部分烃类可直接被微生物降解[3-4].因而，在众多的修复、治理石油烃污染技术中，微生物修复技术被广泛研究和应用.微生物修复技术是指微生物通过自身的代谢活动，使得环境中残留的有毒有害物质转化为无毒无害物质或使其含量减少[5].微生物法具有高效、降解彻底、环保等诸多优点，可以将石油烃降解，转化为无毒的化合物[6-7].

微生物修复石油污染的关键因素则是寻找高效的石油降解菌株.在自然环境中，具有降解石油烃能力的微生物种类繁多、分布广泛.已报道的研究中，被应用的石油烃微生物降解菌已经多达100多属200多种[8].其中，石油烃类降解的微生物中细菌的降解效果最为显著，在已报道的降解石油烃细菌中假单胞菌属(pseudomonas)是常见的一种.另外，还有铜绿假单胞菌属、交替假单胞菌属等对石油烃降解的相关研究报道[9-11].本文从松原油田石油污染土壤中筛选、分离出一株以石油烃为唯一碳源的降解菌株，对其菌落进行了观察，通过16S rDNA 序列分析对其进行鉴定为类产碱假单胞菌，并研究其降解石油烃特性，旨在丰富石油烃的降解菌种，揭示菌株降解石油烃的潜力，为实际石油烃污染场地的修复提供理论依据及降解菌源.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

无机盐液体培养基：

(NH4)2SO42 g，K2HPO41.55 g，NaH2PO40.85 g，MgCl2·6H2O 0.1 g，FeSO4·7H2O 0.005 g，CaCl2·2H2O 0.001 g，1 mL微量元素储备液，补足蒸馏水至1 000 mL.

LB液体培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.4～7.6.

固体培养基：在LB液体培养基中加入1.5%的琼脂.

石油烃培养基：于上述无机盐培养基中加入0#柴油.

主要仪器设备：LD4-2A 医用离心机、气相色谱仪(Agilent7890B)、BXM-30R立式压力蒸汽灭菌器、SP-DJ垂直净化工作台、HZQ-QX 全温振荡器、PTC-200 型 PCR 仪(美国)等.

1.2 实验过程

1.2.1 总石油烃测试方法

1.2.2 菌落形态观察

于锥形瓶中制备100 mL LB液体培养基，向培养基中接入菌株，置于130 r/min、30 ℃下振荡器培养24 h，从而制备菌悬液，并将菌悬液稀释至10-8个/L，取50 ul菌液涂布于LB固体平板培养基上，置于30 ℃生化培养箱中培养48 h，观察、记录菌落形态.

1.2.3 菌株的16S rDNA鉴定

所用细菌通用引物：上游引物7F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；下游引物1540R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3(委托上海生工生物工程技术有限公司完成引物合成和PCR产物的测序).

PCR扩增程序：96 ℃预变性1 min，96 ℃变性10 sec，50 ℃退火5 sec，60 ℃延伸4 min，总计25个循环；最后于4 ℃冷藏保存.然后取5 μL 反应液与1 μL 6×上样缓冲液进行混合，PCR反应的产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测.

1.2.4 菌株降解石油烃特性

(1)温度对菌株降解石油烃效果影响的研究

配置100 mL无机盐液体培养基，加入0#柴油，使其浓度为2 000 mg/L，然后接入5 mL菌悬液，同时辅以加入0#柴油、不加菌的无机盐液体培养基作为空白对照，实验设置2个平行样品.置于130 r/min，温度分别为25、30、35、40、45、50 ℃的振荡器中培养.6 d后，每个样品分别取50 mL，各加入10 mL正己烷进行液液萃取.萃取后的有机相采用无水硫酸钠进行脱水，最后经GC检测样品中总石油烃的残留量，从而计算菌株对石油烃的降解率.

(2) pH值对菌株降解石油烃效果影响的研究

调节含有2 000 mg/L 0#柴油的无机盐液体培养基pH值分别为5、6、7、8、9，分别加入5 mL制备好的菌悬液，同时辅以加入0#柴油、不加菌的的无机盐液体培养基作为空白对照，实验设置2个平行样品.然后将样品置于130 r/min、35 ℃的振荡器中培养.6 d后，每个样品分别取50 mL，各加入10 mL正己烷进行萃取.萃取后的有机相采用无水硫酸钠进行脱水，最后经GC检测样品中总石油烃的残留量，从而计算菌株对石油烃的降解率.

2 结果与讨论

2.1 菌落形态观察

由图1看出，该菌落呈白色不规则状、表面粗糙、边缘不整齐.

图1 菌落形态图

2.2 菌株的16S rDNA鉴定

2.2.1 菌株PCR扩增

菌株的PCR扩增结果如图2所示

图2 菌株的16S rDNA PCR 扩增产物电泳图

由图2可以看出，菌株16S rDNA PCR扩增产物为一个1 500 bp左右的片段，测序结果表明其16S rDNA 序列全长为1 476 bp，这说明是其扩增产物，符合测序要求.

2.2.2 16S rDNA序列分析以及系统发育树的构建

将所得TM菌株的序列信息输入到Gen Bank数据库进行BLAST分析，选择同源性大于98%的基因序列，用Bioedit和MEGA5.0软件对系统发育进行分析，之后用Neighbor-joining构建系统发育树，500次重复检测，计算自引导值(Bootstrap)以估计系统进化树的置信度.结果如图3所示.

图3 菌株基于16S rDNA的系统发育分析

由图3可知，与该菌株同源性最高的可培养菌株为Pseudomonas pseudoalcaligenes strain，因此，推断该菌株为类产碱假单胞菌.在已有的关于污染物微生物降解的研究中，仅有关于该菌株降解硝基苯动力学的报道[12]，而关于该菌株在石油烃微生物降解方面未见报道.

2.3 温度对菌株降解性能影响

温度对类产碱假单胞菌株降解特性影响结果如图4所示.

培养温度/℃图4 不同温度下类产碱假单胞菌降解石油烃效果

温度的降低或升高会影响到菌株细胞膜的流动性及相结构，影响微生物细胞内的酶活性，也会影响支链脂肪酸和环状脂肪酸的比例等，从而影响菌株的生长率[13].除了嗜热菌株和嗜冷菌株外，大多数菌株在外界环境温度为20～40 ℃时生长最适宜.考察菌株生长温度，选择菌株最佳的生长温度，有助于维持细胞内的酶活性，提高微生物降解有机物的速率，从而促进微生物对石油烃的降解.由图4可知，该菌株在35 ℃时，对石油烃的降解效果最好，降解率达到75.4%.当温度逐渐升高或者降低时，菌株对石油烃的降解率也随之降低.