基于DNA检测的肉制品鉴伪技术研究进展

庞博文,王勤志,王俊涛,夏 宁,滕建文,韦保耀,黄 丽

(广西大学轻工与食品工程学院,广西南宁 530004)

肉制品掺假和伪造现象主要有三大类:一是在高值肉类中掺入低值肉,二是以杂交品种肉冒充纯种肉,三是使用伪造或错误的食品标签。国际上关于肉类产品标签错误的事件主要是肉制品成分标识不清晰、不准确[1-4]。意大利的加工肉类产品中标签错误率高达57%[1],鱼片的标签错误率达42.8%[2]。在美国销售的肉类产品中标签错误率达35%[3],水产肉类中的虾和对虾达24.4%[4]。这些掺假伪造行为多与经济效益、食品原料和宗教信仰等关系紧密,且往往不易被消费者察觉。此外,某些潜在的未申报物种如不同种类的软体动物等也可能作为过敏源被掺入掺假肉制品中,这对过敏消费者构成严重的健康威胁,故有必要采取科学有效的鉴伪方法。

目前,应用于肉制品鉴伪领域的检验技术种类繁多,如早期开发的感观分析、电泳分析、液相色谱等,也包括逐步发展起来的与PCR相关的技术[5],如qPCR、ddPCR、Multiplex PCR和ISSR-PCR[6]等,还包括ELISA、Bar-HRM、LAMP、RFLP、Microsatellites等。其中qPCR多用于物种鉴定,RFLP多用于肉类品种鉴别,Microsatellites、NGS多用于同时鉴定食品中的动植物种类,HRM多用于传统肉制品鉴伪,DNA barcoding用于肉制品中掺入植物源物质的鉴别,ddPCR用于肉制品掺假检验,LAMP、Multiplex PCR多用于PDO(受保护的原产地名称)认证,Bar-HRM则多用于肉类物种发源地认证。但有些分析技术因其局限性而无法满足对当今社会高端造假手段的鉴别[7],故需要对有发展潜力的强势技术进行更深入的研究。

本文综述近五年(2014～2019)报道的基于DNA的肉制品鉴伪方法[8],包括食品认证领域内的新兴鉴伪技术,也包括沿用至今的经典鉴伪技术,以期为肉制品鉴伪的相关研究提供参考。

1 肉制品鉴伪PCR技术

1.1 PCR鉴定的原理和优缺点

PCR是一种生物体外的聚合链式扩增反应,可以在几小时内通过引物和酶对特定的核酸序列进行数百万次扩增。常规PCR方法的原理是经PCR扩增特异性片段后,利用琼脂糖凝胶电泳,观察电泳后的结果,根据阴阳性或片段大小以鉴定区分不同物种。PCR因具有灵敏度高、特异性强、分析速度快且成本相对较低等优势,已经成为肉类掺假检验领域的常规技术方法,且得到了广泛的应用。但普通的PCR技术耗时长、操作复杂、成本昂贵且技术要求高,不能满足肉类市场的管理需求。因而,许多与PCR相关的改良技术被提出。

1.2 PCR相关技术

1.2.1 多重PCR 多重PCR方法是将多个引物对用在一个PCR反应体系中,利用一个模板反应可以得到多个扩增片段,在一次PCR反应中使用基于细胞核DNA和线粒体DNA的多个引物对,可以精确检测多种物种成分。故其被广泛应用于食品中存在的物种的检测和分化[9]。

多重PCR分析可通过使用物种特异性引物同时鉴定多个物种,在进行灵敏的定性测定时,通常选择具有高细胞拷贝数的线粒体DNA。尽管PCR测定的可用性在很大程度上取决于目标DNA的质量和数量,但通过使用热循环仪对目标DNA分子的指数扩增,可产生高达数百万的扩增量,并可检测到复杂基质中浓度极低的目标物。目前已经开发了针对线粒体区域的多重PCR测定,以同时检测肉中的不同动物物种,检测灵敏度低至1 pg DNA[10-13]。此外,在掺假的肉丸中可识别出低至0.1%的狗、大鼠和兔肉[14-15]。然而,由于每个细胞的拷贝数在同一个体内的物种、个体甚至组织之间发生变化,使得线粒体基因不适合量化。因此,在需要量化以确保食品真实性的情况下,选用核基因更为合适[16]。

多重PCR技术既继承了常规PCR的优点,又可以在同一次反应中检测多个物种,大大节约了实验成本。但多重PCR技术也存在不足之处,其检测重数越多,效率一致性往往越低。针对MPCR扩增效率一致性的问题,传统单管多靶标扩增的方式通过不断优化反应体系中缓冲液、酶、引物、探针等的用量,确保每一重的扩增效率保持一致,然而随着检测重数的增加,形成二聚体甚至多聚体的可能性也大幅上升,轻则导致非特异性扩增的出现,靶标扩增效率下降,检测灵敏度和特异性降低,重则导致非特异性扩增占据主导,靶标扩增失败,造成假阳性和/或假阴性,影响检测准确性[17]。

1.2.2 qPCR qPCR是在常规的PCR体系中添加荧光基团,利用机器监测荧光信号的变化,可以实时监控PCR反应过程,以实现对样品的定性和相对定量。在物种鉴别中,qPCR是比较先进的技术,结果直观易观察,避免了琼脂糖凝胶电泳中的污染问题。

qPCR在灵敏度、多路复用、分析速度和成本方面超过了传统技术,是混合食品中掺假定量评估的首选方法。qPCR检测中核酸被扩增,并通过实时监控测量来自双链DNA结合染料释放的荧光,其可在每个PCR循环中测量[18]。已有研究表明,用qPCR可同时检测野味肉中的不同动物物种,例如有学者检测出了四种不同鹿肉的具体含量[19-22]。同样,qPCR被用来检验原料和加工清真产品中是否存在禁用的肉类(如猪肉)[23-24]。关于海产品,最近已采用qPCR系统专门检测金枪鱼产品的欺诈或错误标签[25]。

多重qPCR也被用来检测乳制品的欺诈和错误标签现象[26-28]。李志娟等[29]根据甲鱼线粒体细胞色素b基因中的保守区域设计甲鱼特异性引物及Taq Man探针,用RT-qPCR方法检测出市售假冒甲鱼肉的存在,最低检出浓度为0.005 ng/μL,且与其他肉源性成分均无交叉反应。因为靶DNA区域具有高特异性,故可在低浓度下对肉制品中某些物种进行定性检测,但不同的加工方式生产出来的肉制品(如加热温度不同)对PCR效率和精度有影响,使得绝对或相对量化具有一定局限性[30]。

1.2.3 数字PCR 数字PCR(ddPCR)从概念提出到商业化生产在短短几十年间经历了飞速发展。根据分液方式的不同,数字PCR主要分为微孔板数字PCR、微滴数字PCR以及芯片数字PCR。最初,分配分子模板是在96/384孔微孔板中进行,面对复杂的样品仍采用手动稀释加样方法,会带来巨大加样误差。由于数字PCR技术的准确程度取决于反映单元的总数,即反映单元数目越多,越有利于数字PCR的准确度。因此,96/384孔板也无法满足反应需要[31]。其中,ddPCR包括将扩增反应大量分配成纳升大小的样品,其被包封成油滴,以便在每个单独的液滴上进行一次PCR[32]。ddPCR在灵敏度与精密度方面均优于qPCR,且无需制作标准曲线即可测量靶DNA含量,该技术已成功应用于肉制品的鉴伪和定量[33]。

1.2.4 其他PCR鉴定方法 食品控制和真实性领域研究的主要目标是开发出一种可即时对食品进行分析的技术。为此,基于PCR的方法与其它技术(如微流体、生物传感器或纳米技术)的结合已经引起了现场应用领域学者们的兴趣。

Furutani等[34]使用便携式qPCR系统,在20 min内成功实现了对加工食品中牛肉、猪肉、鸡肉、兔肉、马肉和羊肉的准确鉴定。Lin等[35]报道了一种基于物种特异性探针的方法,该探针靶向细胞色素c氧化酶亚基1基因(COI)结合流通杂交检测,用于多种肉类的鉴定(多重鉴定),因为该测定快速且相对便宜,所以适合常规测试用。Wang等[36]描述了一种光学-薄膜-生物传感器测试,该测试可以通过肉眼可感知的颜色变化监测和区分多达八种肉类,检测限低至0.001%。Kitpipit等[37]提到了一种可通过PCR扩增,直接在样品上检测六种常见肉类的方法,该方法可减少样品前处理。在另一项研究中,有学者使用基于cytb基因对流Palm PCR的超快速方法鉴定肉类,该方法具有很高的现场应用潜力[38],与标准PCR相比,该方法避免了反应在不同温度间的骤然变化,可使用单重或多重程序在24 min内完成对目标物种的检测,可检测掺假量低至1%的肉制品。Taboada等[39]开发了一种物种特异性四链体PCR系统,并通过侧流式试纸(LFD)进行检测,以便在海产品中对两种鳕鱼物种进行原位筛选。LFD因其具有便携性和简单性,且可对结果进行肉眼监测,而被证明有很强的实用性。据报道,在这种情况下使用基于凝胶的扩增产物检测的类似多重PCR检测方法可区分五种可食用或潜在可食用的水母物种[40]。

近五年来,与PCR相关的技术应用于肉制品鉴伪领域的代表性研究如表1所示。

表1 PCR相关的肉制品鉴伪技术

续表

2 DNA条码

DNA条形码由测序和比较直系同源DNA区域组成,用于分类鉴定,是目前用于活体动物生源地鉴定的标准化方法[41]。目前,在动物研究中,基于线粒体细胞色素c的基因,通过使用短的标准DNA片段对物种进行精准识别和高效鉴定的方法已被广泛应用[42]。DNA条形码,通过使用传统的Sanger DNA测序仪或NGS技术,有效推动了食品种类鉴定和可追溯性方面的进步[43]。DNA条形码技术的难点在于找到某种理想的目标基因,这种基因在某个分类群中呈现低变异性,但具有高水平的物种间变异性。因此,检测几个物种中的保守区域可达到区分物种的目的。用于区分物种的较有针对性的基因是COI、细胞色素b基因(cytb)和用于动物物种鉴别的maturase K(matK)基因。这些基因相比线粒体和质体DNA的优势在于其在细胞中存在较高数量的复制体,这也使其成为大多数定性方法中的目标基因,其中需注意的是要用高灵敏度的方法来检测低浓度的相应物种的目标基因[16]。由于DNA的降解,在中等或高度加工和保存的产品中对于标准长度(约650 bp)条形码的PCR扩增是具有难度的。然而,专注于较短DNA片段(100～200 bp)的小型条码编码方法已通过鱼类产品认证测试,成功率达到93%(使用标准长度条码时为20.5%)[44]。

学者投入了大量精力创建了全球生命数据系统(BOLD),为几乎所有生物创建了条形码公共数据库。与肉类相比,可食用海产品和植物的多样性更高,因此要区别相似的个体是具有难度的,特别是在加工食品中。在许多情况下,条形码分析可以检测到低百分比的错误标记,但由于物种的高度相似性,有时难以判断欺诈是故意的还是无意的。此外,为了区分和识别不同鱼类,目前已建立了包含所有鱼类的标准化参考序列的鱼类生命条形码倡议(FISH-BOL)公共资料库。如今,DNA条形码技术已成功应用于包括新鲜、冷冻和其它加工产品在内的海产品的欺诈和错误标签检测[45-51]。

3 新型鉴伪技术

3.1 高通量测序

近年来,DNA条形码方法已被整合到高通量测序格式(原为下一代测序,NGS)中,证明了其具有同时鉴定食品中动物和植物物种的高潜力。NGS对基因组研究产生了变革性的影响,其能够并行地对数百万个小DNA片段进行测序[52],且因NGS可进行实时检测,省去了反应的后续步骤,故其比Sanger测序速度更快,通量更高。近年,DNA条形码和焦磷酸测序技术的结合已成功用于鱼类、海产品[53-55]、肉及肉制品[56]的鉴定中。同样,可以在乳制品中检测到包括未申报物种和人类DNA在内的其它动物物种来源[57]。

3.2 高分辨率熔解曲线分析其及延伸技术

高分辨率熔解曲线技术(HRM)是一种快速、高通量的技术,其可根据反映遗传变异的特定DNA扩增子的解链温度(Tm)进行基因分型和序列匹配(以及因此对分类群的区分)[58]。这种在PCR后使用荧光嵌入DNA染料的方法,当温度升高时,可以监测dsDNA变性情况。HRM的分辨能力依赖于序列分歧,因此,即使少数碱基对差异也会改变熔解曲线,所以当被分析的DNA序列相似度极高时,要区分不同物种是比较困难的。HRM可同时检测多达8种不同的肉类动物,检出限为0.1 ng DNA。在一项涉及蜂蜜的昆虫学鉴定的研究中,有学者通过分析蜂蜜样品成功鉴定出了蜜蜂物种[59]。

2010年开发的另一种方法是HRM与DNA条形码的组合,称为Bar-HRM,当用于物种和亚种分化时,它有很大的潜力。该方法包括基于来自条形码标记的序列设计HRM特异性引物。与DNA条形码技术相比,Bar-HRM的优势在于可以实现定量测量,且其具有比传统熔解曲线分析更高的分辨率[60]。据报道,有学者用Bar-HRM区分了五种最具商业价值的虾类,其鉴定精度达到99%以上[61]。另有学者采用相同的方法区分了五种鳕鱼(高价值且易被掺假)[62]。

3.3 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术(LAMP)是日本学者Notomi在2000年提出的一种适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术,该技术已被用于食品认证领域。与PCR和qPCR一样,LAMP也可以检测特定的DNA序列,且可以测定多达八种不同的靶向序列。LAMP方法使用自我重复的链置换DNA合成,在恒定温度下复制靶DNA,并避免了PCR扩增的冗长步骤[63]。

在关于清真食品的评估中,qLAMP以及针对猪肉特异性DNA的LAMP和电化学发光(ECL)传感器的组合已经可以检测出含量低至0.01%的牛肉、猪肉和0.1 pg/μL的猪肉DNA[64-65]。LAMP-ECL传感器除了具有高灵敏度外,还可以用作紧凑、简单、快速(约5 min检测)的生物传感器,可用于现场食品认证评估。有学者使用LAMP方法同时检测了八种不同肉类[66]。在现场应用方面,将特定的LAMP反应与LFD组合可开发出能够检测低至10 pg哺乳动物物种DNA的快速测试生物传感器[67]。

LAMP技术不需要进行反复热循环扩增,避免了反复升降温的耗时过程,可实现恒温条件下的快速扩增,弥补了传统PCR反应的缺点。其通过加入荧光染料或荧光基团,利用目视比色或仪器法确定检测结果,能较好地检测出肉制品中的掺假情况。

4 经典DNA标记

广泛用于群体遗传学研究的经典DNA标记技术,如微卫星、RAPD、扩增片段长度多态性(AFLPs)、RFLP、序列特征扩增区域和(最近)单核苷酸多态性(SNP)已被证实在肉制品鉴伪领域非常实用[2,68-69]。现多将其中的某几种技术结合起来使用,如RFLP结合PCR也是一种基于DNA的分析方法,通常可用于食品的物种鉴定中。然而,这些技术相比于DNA条码技术,其灵敏度和选择性低,且操作更为繁琐。目前,PCR-RFLP已被广泛用于鉴定海产品中掺杂的物种,并且该技术也适用于肉制品鉴伪。在RFLP中,经PCR扩增后,使用酶消化靶DNA,并通过凝胶电泳监测所得的限制性图谱,即可通过比较不同样品的图谱来鉴别物种[70]。董传举等[71]通过PCR-RFLP技术,使用一组引物分别对8种鲟鱼线粒体基因进行PCR扩增,并分别应用限制性内切酶TaqαI、Ava II和Eag I-HF、Nae I对扩增产物进行酶切,使用3.0%的琼脂糖凝胶检测其酶切结果,在保证鱼种存活基础上仅剪取少量鱼鳍,便快速准确地鉴别出了8种鲟鱼易混种中的中华鲟、小体鲟、达氏鳇以及欧鳇。韩镌竹等[72]以纯羊肉为原料,按2%、5%和10%的重量比在羊肉中掺杂鸡肉、猪肉和鼠肉,通过基因组DNA提取试剂盒法提取DNA,并采用PCR-RFLP技术成功的同时检测出羊肉中的掺杂肉类,检出限为2%。Subbiah等[73]使用PCR-RFLP技术对收集到的来自全国各地的样本中的肉类进行了溯源性检测,并利用物种特异性PCR鉴定了肉牛和水牛样品,在112份样本中,鉴定出7.14%的雌性牛和56.25%的雄性牛,并检测出有11个样品为水牛和肉牛,有2个绵羊肉、1个山羊肉和2个鸡肉样品,此外还发现样品中有骆驼肉的存在。Sunutcha等[74]基于PCR-RFLP技术,测定了细胞色素b、12S和16S rRNA的PCR产物序列,并用Alu I和Hinf I两种不同的限制性内切酶进行切割,成功的检测并区分出泰国海域海蛇的血液、蛇皮、生肉、熟肉、海蛇-鱼二元混合肉和海蛇-猪二元混合肉,该技术可应用于海蛇肉制品市场的掺伪鉴别,且对于追踪海蛇物种被捕获的时间和评估泰国水域海蛇的保护和管理有重要意义。有学者通过靶向线粒体区域的PCR-RFLP区分了5种金枪鱼种类、9种不同的鲷鱼种类和16种商业海参种类[75-77]。RFLP方法也被用于检测混合物和肉丸中含量低至0.01%的猫肉[78]。尽管是最常用的技术之一,RFLP分析和其他经典DNA标记技术的使用也未必能获得可靠的定量信息。此外,因为分析基于可以与参考样品比较的指纹样扩增模式,所以它们难以标准化。

SNP是单个位置的DNA序列变异,其已被证明在人类疾病的诊断中非常有用。SNP分析可以区分那些亲缘关系很近的样本[79],因为分析侧重于单核苷酸变化而不是整个序列,所以该方法特别适用于鉴定相似度高的品种[80]。表2汇编了使用这些经典DNA标记进行食品认证的最新研究。

表2 经典DNA标记物在食品鉴伪方面的应用

5 结论与展望

对于肉制品的鉴伪方法,其首先必须满足准确和可靠的要求。此外,由于高度分散的靶DNA分子间的差异性很小,且十分敏感,因此,鉴伪方法还应具有高度特异性。同时,鉴伪方法应具有高通量能力、分析时间短的特点,以便快速的检测出掺假成分。目前开发的鉴伪技术如NGS、DNA-metabarcoding、Bar-HRM、LAMP和ddPCR等已经超越了传统的鉴伪方法。

目前,纳米粒子已经被纳入食品应用,例如过敏原和有毒化合物的检测[81-82]以及食品安全认证[83]。而采用微流体装置和纳米粒子,改进了复杂食品基质DNA的回收和提取过程[84-85],为肉制品鉴伪技术的进一步发展提供了技术支持。在未来的鉴伪技术中,把数字PCR和LAMP等技术与微流体和纳米流体系统以及新型纳米生物传感器系统结合,将会显著提高这些基于DNA的鉴伪方法的效力[86-88]。基于纳米粒子的生物传感器,由于可实现大规模的平行试验,且具有便携式分析平台,省去了传统方法中样品制备的繁琐操作,也将会成为今后的重要研究趋势之一。