郫县豆瓣后发酵期氨基酸呈味效果评价及其ACE抑制肽动态分析

彭 杰,冉玉琴,徐炜桢,杨国华,张 良,*

(1.西华大学食品与生物工程学院,食品生物技术四川省高校重点实验室,四川成都 610039;2.四川省丹丹郫县豆瓣集团股份有限公司,国家企业技术中心,四川省豆瓣酿制工程实验室,食品用酶生物发酵技术国家地方联合工程研究中心,四川成都 611732)

郫县豆瓣生产工艺独特,具有味辣香醇、粘稠绒实、红棕油亮、酱香浓郁等特点[1-2]。其生产工艺可分为前发酵和后发酵两个阶段,前发酵主要是指豆瓣的制曲过程和辣椒坯的预处理[3-4]。后发酵主要是将成熟霉瓣子和成熟辣椒坯按比例混合,加入适量食盐和水,进入工业条池或传统陶缸,再经一定时期特有的“翻、晒、露”过程[5-6]。郫县豆瓣的后发酵是一个复杂关键的过程,其中除了微生物之间的代谢作用还包括各类化学成分之间的相互作用,从而形成了郫县豆瓣独特的成分和风味。

氨基酸是蛋白质分解的产物之一,它对郫县豆瓣的色泽、香气等方面有一定的调节作用,是评价郫县豆瓣质量的重要指标。在“地理标志产品郫县豆瓣”的国家标准[7]中,也将氨基酸态氮的含量高低作为郫县豆瓣质量等级划分的重要依据。食源性ACE(血管紧张素抑制酶)抑制肽是由蛋白质水解得到,它可以通过与ACE结合,起到降低血压的作用,更因其与化学药物相比具有高安全性、无毒副作用,且易吸收、成本低的优点,从而成为研究的热点[8-9]。目前大部分研究均集中于肽的生物功能特性上,但是在食品加工中,部分肽类除了赋予食品生物学功能特性之外,还为食品提供了基本呈味成分[10]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

郫县豆瓣后发酵1月、2月、3月、6月、9月、1年及2年的样品 成都知名郫县豆瓣生产企业的生产车间;天冬氨酸、苏氨酸、脯氨酸等氨基酸标准品 英国柏楉有限公司(Biochrom);血管紧张素转化酶(取自兔肺)、马尿酰-组氨酰-亮氨酸溶液(N-hippuryl-His-Leu tetrahydrate,HHL) 美国Sigma公司;马尿酸标准品(hippuric acid,Hip) 酷尔化学科技(北京)有限公司。

30+氨基酸自动分析仪 英国Biochrom公司;Heto lyolab 3000冷冻干燥机 赛默飞世尔科技公司;LC-16液相色谱仪 岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 氨基酸态氮含量测定 氨基酸态氮含量均参照GB/T 20560-2006《地理标志产品 郫县豆瓣》[7]所述的方法检验。

1.2.2 氨基酸含量测定 称取豆瓣2.00 g加入适量蒸馏水,在功率300 W(常温)条件下超声提取1 h后,过滤,将滤液稀释20倍,经0.22 μm微孔滤膜过滤后采用氨基酸自动分析仪分析。测定条件:Biochrom Li 型阳离子交换树脂4.6 μm×200 mm,测定波长570、440 nm;缓冲液流速25.0、31.2 mL/h,柱温31～76 ℃,茚三酮溶液流速20.0 mL/h,分析时间125 min,进样量20 μL。每个样品重复进样3次。

1.2.3 游离氨基酸对滋味的贡献度 味道强度值(Taste activity value,TAV)[27]表示各个呈味物质的含量与其阈值的比,本文中以氨基酸自动分析仪测得的游离氨基酸浓度与其对应的阈值[28]之比计算TAV。当TAV值大于1时,认为该物质对呈味有贡献,而TAV值小于1时认为该物质对呈味没有贡献。此方法并未考虑滋味间的消杀、相乘作用,故存在一定局限性。

1.2.4 ACE抑制肽测定

1.2.4.1 马尿酸标准曲线测定 取1 mmol/L的马尿酸标准溶液,用双蒸水分别稀释成0.5、0.1、0.05、0.01、0.005 mmol/L系列浓度,经0.45 μm滤膜过滤后,进样分析后得到对应的峰面积。以马尿酸标准溶液浓度(X)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线,y=2624700x+9355.96,R2=0.99978。这表明马尿酸标准溶液在0.005～0.5 mmol/L浓度之间与峰面积的线性关系良好。

1.2.4.2 豆瓣酱中ACE抑制肽的提取 采用李风娟等[29]、刘婉璐等[30]的方法略作改进,郫县豆瓣在-50 ℃条件下冷冻干燥24 h后粉碎。准确称取0.500 g冻干粉,加入5 mL蒸馏水,涡旋振荡2 min充分混匀。超声功率100 W条件下提取10 min后,再沸水浴10 min。将所得样液在4000×g条件下离心10 min,上清液以0.45 μm膜过滤待用。

1.2.4.3 豆瓣酱ACE抑制肽活性测定 在赖晨戎等[31]、庹康秀等[32]、姜瞻梅等[33]、吴琼英等[34]的方法略作改进。取20 μL 5 mmol/L HHL溶液加入5 μL样品溶液混合均匀后,37 ℃水浴5 min,随后加入20 μL ACE溶液混匀作为样品组溶液,在37 ℃水浴30 min后加入5 μL 1 mol/L HCl终止反应(对照组以5 μL 0.1mol/L硼酸硼砂缓冲液(pH=8.3,含0.03 mol/L NaCl)代替样品)。反应液0.45 μm过滤后用HPLC进样分析。

1.2.4.4 检测方法 Kromasil C18色谱柱(5 μm,250 mm×4.6 mm),流动相:25%乙腈(含0.05% TFA)-75%超纯水(含0.05%TFA),检测波长228 nm,柱温25 ℃,流速0.8 mL/min;进样量10 μL,每个样品重复进样3次。

1.2.4.5 ACE抑制肽活性计算 按以下公式进行计算:

式中:A为空白对照组中马尿酸的峰面积;B为样品中马尿酸的峰面积。

1.3 数据处理

样品选取同一后发酵时间的不同发酵池进行3次重复取样,测定后计算平均值。采用Excel对数据进行整理统计分析;采用Origin 8.3分析作图。

2 结果与分析

2.1 不同后熟期郫县豆瓣氨基酸态氮含量变化分析

郫县豆瓣中氨基酸态氮主要来自于原料中蛋白质的水解和发酵微生物的自溶,它在评价调味品质量及营养价值等方面具有重要意义[35]。如图1所示,郫县豆瓣中氨基酸态氮的含量随发酵时间增加呈先上升后下降的变化规律,最高含量为0.422 g/100 g(9个月),高于国家标准中特级郫县豆瓣的要求(≥0.25 g/100 g)[7]。后发酵1年(0.361 g/100 g)和2年(0.375 g/100 g)的郫县豆瓣氨基酸态氮含量无明显差异,但均高于后发酵6个月的郫县豆瓣中氨基酸态氮含量。郫县豆瓣中氨基酸态氮含量变化与韩国黑豆酱(Daemakjang)[36]和印度虾酱(Kapi)[37]的中氨基酸态氮含量变化相似,且郫县豆瓣中氨基酸态氮含量(平均0.356 g/100 g)要高于韩国黑豆酱(<0.200 g/100 g)。

图1 不同后熟期郫县豆瓣的氨基酸态氮含量

2.2 不同后熟期郫县豆瓣游离氨基酸动态变化分析

为了进一步明确郫县豆瓣后发酵期游离氨基酸的变化情况,揭示其作为发酵调味品生产过程中最复杂和最重要的蛋白质降解情况,不同后熟期郫县豆瓣游离氨基酸动态变化情况见表1。从表1可以看出,郫县豆瓣含有20种氨基酸,其中有7种是人体必须氨基酸。发酵各阶段含量较高(≥1.00 mg/g)的4种氨基酸分别为:天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和脯氨酸,它们之和占各阶段郫县豆瓣所有游离氨基酸总量的百分比均在45.58%及以上。

表1 不同后熟期郫县豆瓣氨基酸动态变化(mg/g)

游离氨基酸的总量随发酵时间的延长至6个月时达到最高,随后在1年内趋于稳定,发酵至2年时开始下降。浓度相对升高且总量相对最大的天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸,与酵母自溶溢出的氨基酸中质量浓度较高的氨基酸基本相同[38-39],这说明后发酵阶段酵母自溶对郫县豆瓣中氨基酸态氮的增加可能有很大关系。通过研究郫县豆瓣后发酵期真菌变化的情况,发现目水平相对含量最高的酵母目(Saccharomycetales)占63.21%,而随着后发酵周期延长,多样性和相对总量开始下降[22]。因此,可以推测酵母细胞自溶过程中氨基酸自溶溢出,对郫县豆瓣呈味物质组成做出了较大贡献,这与潘慧青等[40]对黄酒酿造工艺影响氨基酸态氮合成的研究报道一致。

另外,一些消耗氨基酸的反应未发生,或消耗氨基酸的反应相比蛋白质水解生成氨基酸的速度慢,可能也是游离氨基酸得到有效积累含量较高的原因。氨基酸是豆酱等大豆类发酵调味品的风味形成的重要前体物质,与二羰基化合物发生Strecker反应,与Mailard反应的中间产物发生交互作用,生成郫县豆瓣特殊的香味物质,赋予豆酱典型的色泽[41]。随着发酵的进行,氨基酸逐渐被消耗、反应形成郫县豆瓣典型的风味和颜色,因此含量逐渐降低。

后发酵6个月的郫县豆瓣中的天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸所占郫县豆瓣全部游离氨基酸的比例达到了11.93%、8.88%、14.03%,其构成比例显著高于我国东北豆酱[42]和韩国豆酱(cheonggukjang)[36],特别是脯氨酸的绝对含量,远高于以上两者。脯氨酸在蛋白合成、机体的新陈代谢、伤口愈合、抗氧化及免疫反应均发挥着重要的调控作用[43],这为从大健康角度深入研究郫县豆瓣提供了一种新的思路。

游离氨基酸的总量在各阶段中后发酵1个月最高占氨基酸态氮含量的5.21%,这说明郫县豆瓣中还含有大量未水解的蛋白质、酶解蛋白和小肽类含氮物质,其中的呈味肽、酶解蛋白可能对郫县豆瓣的风味影响更大,尚需要深入的研究。同时,发酵原料的蛋白质含量、发酵过程中蛋白质酶的活性等诸多因素均影响着郫县豆瓣后发酵期游离氨基酸的变化情况。若要提高郫县豆瓣氨基酸态氮的含量,只需要单纯提高发酵原料中胡豆瓣的比例即可,但原料的组成配比,对郫县豆瓣的风味影响更大。

2.3 不同后发酵期郫县豆瓣氨基酸呈味效果评价

氨基酸是一种重要的呈味物质,氨基酸组成与滋味的形成具有密切的关系。根据氨基酸的味觉强度可大致分为甜、鲜、苦和无味四大类,并计算其TAV值,结果如表2所示。TAV数值越大,贡献越大[44],用(+)表示;反之,则呈味作用不显著,用(-)表示。

表2 不同后熟期郫县豆瓣氨基酸TAV值

由表2可以看出,各个阶段中天冬氨酸和天冬酰胺的TAV值>1的氨基酸,它们对郫县豆瓣的滋味构成发挥了重要作用。除此之外,呈鲜味的谷氨酸的TAV在发酵1个月之后均高于8.00,且在发酵9个月时最高,达到了13.63,远高于其他几种呈味氨基酸的TAV值,对郫县豆瓣后发酵过程中滋味的形成贡献最大,这与酸菜自然发酵过程中风味的形成相似[45];在发酵9个月时，呈现甜味的丙氨酸和呈现甜苦味的精氨酸占比也较大,为增加郫县豆瓣口味的复杂性、厚重感也做出了一定贡献,造就了郫县豆瓣独特的品质和滋味。有报道指出,聚谷氨酸-天冬氨酸(pGlu-Asp)、聚谷氨酸-缬氨酸(pGlu-Val)虽然对鲜味直接促进作用不大,但其能提供强烈的助鲜后味[46-47]。日本学者从25种豆酱中分离出了果糖-谷氨酸聚合物(Fru-Glu),发现其能够有效的提高食物鲜味[48]。

发酵期6个月至2年的郫县豆瓣为成熟产品,在郫县豆瓣后发酵2年内各发酵期中所有氨基酸TAV值(0.03～13.63)均低于酿造酱油(0.45～99.30)[49],但高于食醋(0～11.62)[50]。有学者研究了不同后发酵工艺对黄酒氨基酸生成的影响,发现延长后发酵时间3～9 d与提高发酵温度2～4 ℃均有利于氨基酸态氮和游离氨基酸的积累[40],这与本研究结果差异较大。

18种氨基酸中大部分氨基酸的TAV值随发酵时间的延长而增加,随后减少,在9个月时TAV值达到最大。可能是在后发酵初期(0～9个月),微生物及酶系活动占据主要优势,产生蛋白酶水解蚕豆中蛋白质或微生物代谢产生的蛋白质,导致郫县豆瓣中游离的氨基酸含量增加,这是郫县豆瓣鲜味的主要来源,但由于高盐环境和pH的下降,抑制了这些微生物的生长,使得后期的微生物总数呈下降趋势[38-39],因此氨基酸的含量出现下降,并且Maillard反应和 Strecker氨基酸降解反应开始消耗所产生的游离氨基酸[40]。因此,在后发酵9个月后,氨基酸含量开始下降。

2.4 不同后熟期郫县豆瓣ACE抑制肽变化分析

从图2中可以看出,后发酵期郫县豆瓣中ACE抑制肽活性整体变化是先升高再降低,在后发酵2个月时活性最高,随着后发酵时间的继续延长,ACE抑制肽活性整体呈降低趋势。可能是在后发酵初期,大量的酶类水解蛋白质形成的肽类及氨基酸对郫县豆瓣的ACE抑制活性做出了重要贡献,但随着发酵时间的延长，Maillard反应消耗了大量的氨基酸从而使ACE活性略有降低,与此同时Maillard反应生成的一些产物如蛋白黑素类物质等,对总ACE抑制活性有着重要贡献,可使产品保持稳定的高ACE抑制活性[51];另外在整个后发酵过程中可能存在的其它微生物代谢产物,对ACE抑制具有一定补偿作用。有研究表明发酵豆酱产品具有良好的ACE抑制活性[29-30],但ACE抑制肽基本不存在于原料自身,而是在发酵过程中受到微生物代谢的影响而积累[50]。有研究表明乳酸菌、米曲霉菌、枯草芽孢杆菌均能够发酵产生ACE抑制肽[52],而这些微生物在郫县豆瓣后发酵过程中均广泛存在[21-22],这为挖掘郫县豆瓣的生物活性功能提供了一种新的思路。

图2 不同后熟期郫县豆瓣的ACE抑制肽活性

郫县豆瓣ACE抑制肽活性最高达83.90%,其它值均在70.13%及以上,这与刘婉璐[51]发现的甘露糖体系与纤维二糖体系中ACE抑制肽活性研究中的结果相符。有研究表明ACE抑制肽一般具有亮氨酸、脯氨酸含量高的结构特点[53-54],且丁苗等[53]和王双等[55]也证明纯化后的脯氨酸、酪氨酸、色氨酸等对ACE抑制肽活性贡献较大;另外林凯等[54]也发现ACE抑制肽C末端含有苯丙氨酸时会使其具有较高ACE抑制活性,李风娟等[29]发现后发酵期含量较高的霉菌对ACE抑制活性能产生一些积极的作用。结合表1当中脯氨酸、酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸等的变化情况,由此推测郫县豆瓣后发酵期ACE抑制肽活性较高,可能是因为ACE抑制肽自身结构(氨基酸序列)、发酵体系中还原糖发生的Maillard反应、微生物代谢及产物均对ACE抑制肽的活性起到了积极作用。

有研究表明食品中呈味物质除了游离氨基酸、蛋白质外,肽也发挥了比较重要的作用,且肽在食品中的各种呈味作用是最基本、最传统的[56]。陶正清等[57]发现肽的味感取决于分子结构中亲水基团和疏水基团的含量,其中亲水基与鲜味、甜味等诱人风味相关,疏水基与苦味等令人不愉快的风味相关。同时有研究表明,疏水性氨基酸含量受ACE抑制肽活性影响,因此可以推测ACE抑制肽活性对后发酵期的郫县豆瓣的呈味效果起一定作用。另外在无盐酱油[58]的研究中发现某些咸味肽能抑制ACE活性。由此看出ACE活性与后发酵期郫县豆瓣典型风味的形成有一定联系,具体联系还需要进一步研究。

3 结论

随着后发酵时间的延长,郫县豆瓣中氨基酸态氮含量先增加后降低,在9个月时达到最高0.422 g/100 g,总氨基酸态氮含量在后发酵期1～2年比6个月前的高,且在后熟发酵时间在1～2年后,含量变化不明显。

在郫县豆瓣中,游离氨基酸的总量随时间延长先增加后减少,游离氨基酸总含量在发酵6个月的时候达到最大,随后在1年内趋于平缓,在2年时开始下降;发酵各阶段含量较高(≥1.00 mg/g)的4种氨基酸分别为:天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和脯氨酸,它们之和占各阶段郫县豆瓣所有游离氨基酸总量的百分比均在45.58%及以上。

在后发酵期郫县豆瓣中ACE抑制肽活性在后发酵2个月时活性最高达83.90%,随着后发酵时间的继续延长,ACE抑制肽活性整体呈降低趋势,但其最低值仍有为70.13%;这可能与豆瓣的ACE抑制肽结构及后发酵期中各类微生物之间的代谢作用和演替过程相关;且ACE抑制肽活性与后发酵期的郫县豆瓣的呈味效果之间有一定的联系。

后发酵9个月的郫县豆瓣氨基酸态氮以及游离氨基酸和TAV值与后发酵2年的郫县豆瓣无显著差异,但发酵2年的ACE抑制肽活性则要稍稍优于后者;这或许可为生产企业设定发酵周期,为传统产业现代化改造或者后期开发功能性产品提供科学依据。

郫县豆瓣后发酵期大量的微生物代谢演替及复杂的物质能量代谢过程尚未完全揭示,因此在今后的研究中可以重点关注微生物代谢及演替过程与ACE抑制肽含量的相关性及关键物质基础变化对其的影响。